郭佳婧，李宗軍*，王遠(yuǎn)亮

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

非發(fā)酵豆制品中微生物耐熱機(jī)理探討

郭佳婧，李宗軍*，王遠(yuǎn)亮

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

非發(fā)酵性豆制品殺菌不徹底是影響產(chǎn)品質(zhì)量安全的重要因素之一，本文從微生物自身耐熱機(jī)制和非發(fā)酵豆制品中蛋白質(zhì)對(duì)微生物耐熱性的影響兩方面，初步探討非發(fā)酵豆制品殺菌時(shí)影響微生物耐熱性的因素。

非發(fā)酵豆制品；耐熱微生物；耐熱機(jī)制

我國(guó)在公元前就已開始種植大豆，大豆富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、必需脂肪酸和礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)素[1]。常食豆制品可降低體內(nèi)膽固醇、血脂等，在體內(nèi)起到保護(hù)心血管，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病的作用[2]。豆制品種類多樣，非發(fā)酵性豆制品是目前市場(chǎng)主流豆制品之一，作為傳統(tǒng)豆制品的一種，不但營(yíng)養(yǎng)豐富，而且口味多樣，適于多人群食用[3]。由于非發(fā)酵豆制品蛋白質(zhì)含量高以及微生物的特殊耐熱機(jī)制，使得巴氏殺菌不能達(dá)到理想的殺菌效果，貨架期較短。

王敏等[4]發(fā)現(xiàn)引起非發(fā)酵豆制品的腐敗菌為短小芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌。汪立平等[5]研究腐敗豆?jié){中的腐敗菌為地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和短芽孢桿菌。芽孢的熱抵抗力非常強(qiáng)，尤其在干燥條件下更具有超強(qiáng)的耐熱力，會(huì)明顯影響殺菌效果。通過(guò)研究非發(fā)酵豆制品中微生物自身耐熱機(jī)制以及其中營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)微生物的保護(hù)作用，尋找適宜的殺菌工藝，達(dá)到延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期，保證食用安全的目的，同時(shí)減少經(jīng)濟(jì)資源的浪費(fèi)。

1 耐熱微生物自身耐熱機(jī)制

耐熱微生物是最高生長(zhǎng)溫度在45～50℃之間，低于30℃也能生長(zhǎng)的一類嗜熱菌[6]。而嗜熱菌俗稱高溫菌或嗜熱微生物，指最低生長(zhǎng)溫度45℃左右，最適生長(zhǎng)溫度在50～60℃之間，最高生長(zhǎng)溫度在70℃或70℃以上的一群微生物[7]。獨(dú)特的耐熱機(jī)制是耐熱微生物能夠在高溫環(huán)境中生長(zhǎng)并繁殖的必要條件，這些特殊的耐熱機(jī)制主要包括芽孢、細(xì)胞膜的組成成分、嗜熱酶、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)以及遺傳物質(zhì)[8]。

1.1 芽孢

菌體含有芽孢是其耐熱的主要原因之一。芽孢是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的一種休眠構(gòu)造，形成于產(chǎn)芽孢菌生長(zhǎng)發(fā)育后期，為圓形或橢圓形，具有含水量很低的厚壁，可逆性強(qiáng)[9]。由于沒有新陳代謝，芽孢可經(jīng)受多種環(huán)境傷害，耐熱、耐干燥和耐紫外線等一切物理化學(xué)因素[10]。

芽孢特有的生命構(gòu)造和由此產(chǎn)生的完善的熱脅迫應(yīng)激調(diào)控機(jī)能使得其擁有極強(qiáng)的耐熱性[11]。芽孢的耐熱機(jī)制尚無(wú)統(tǒng)一說(shuō)法，最具代表性的是滲透調(diào)節(jié)皮層膨脹學(xué)說(shuō)。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為，芽孢外層所包裹的疏水性角蛋白即芽孢衣，很難使多價(jià)的陽(yáng)離子和水透過(guò)，同時(shí)離子強(qiáng)度很高的皮層可產(chǎn)生很高的滲透壓奪取核心水分，結(jié)果就是芽孢核心部分失水而皮層部分吸水膨脹，最終導(dǎo)致芽孢對(duì)熱的抗性增加[12]。

1.2 細(xì)胞膜組分

耐熱微生物的細(xì)胞膜由雙層具有高度飽和的脂肪酸構(gòu)成，這些結(jié)構(gòu)特殊的復(fù)合類脂主要是甘油脂肪酰二酯，可形成強(qiáng)大的疏水鍵[13]。復(fù)合類脂隨環(huán)境溫度升高總量增加，并且增加的是熔點(diǎn)高、熱穩(wěn)定性好的直鏈飽和脂肪酸，沒有不穩(wěn)定的不飽和脂肪酸。耐熱微生物的細(xì)胞膜含有異型脂肪酸、穩(wěn)定型脂肪酸和環(huán)烷型脂肪酸，通過(guò)自動(dòng)調(diào)節(jié)磷脂組分來(lái)維持高熔點(diǎn)的液晶態(tài)結(jié)構(gòu)，使其耐受高溫[14]。

1.3 嗜熱酶

在高溫(60～120℃)下具有最佳活性，80℃以上環(huán)境中能發(fā)揮功能的酶稱為嗜熱酶。對(duì)其耐熱性發(fā)揮重要作用的是酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)，其中關(guān)鍵區(qū)域的個(gè)別氨基酸改變就會(huì)引起高級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，增加酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的氫鍵、離子鍵或疏水鍵，從而提高其熱穩(wěn)定性[15]。與常溫菌的同源氨基酸相比，耐熱微生物氨基酸的組成和順序具有更高的穩(wěn)定性。盧柏松等[16]研究認(rèn)為耐熱微生物蛋白質(zhì)中的Leu、Pro和Arg的含量明顯高于常溫菌，這些氨基酸通過(guò)促進(jìn)蛋白質(zhì)的折疊，增加疏水作用及離子間相互作用來(lái)提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。

1.4 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)空腔個(gè)數(shù)和體積、緊密度、疏水性及溫度因子是三維結(jié)構(gòu)中影響其耐熱性的主要因素。丁彥蕊等[17]研究發(fā)現(xiàn)高溫細(xì)菌類蛋白質(zhì)的空腔個(gè)數(shù)和體積小于常溫細(xì)菌類蛋白質(zhì)，認(rèn)為空腔個(gè)數(shù)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的規(guī)整性和緊密性有顯著影響，空腔體積影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。

溫度因子體現(xiàn)了蛋白質(zhì)在晶體中的構(gòu)象狀態(tài)，溫度因子越高，相應(yīng)部位的構(gòu)象就越不穩(wěn)定[18]。Parthasarathy等[19]發(fā)現(xiàn)耐熱蛋白質(zhì)Ser和Thr的溫度因子比常溫蛋白質(zhì)的值小(柔性小)，在高溫度因子區(qū)，耐熱蛋白質(zhì)中Glu和Lys的比例比常溫蛋白質(zhì)大，認(rèn)為溫度因子的差異可說(shuō)明耐熱蛋白質(zhì)和常溫蛋白質(zhì)在動(dòng)力學(xué)方面的差異，并驗(yàn)證氨基酸取代可改變蛋白質(zhì)耐熱性的理論。

1.5 遺傳物質(zhì)

DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性由氫鍵及相鄰堿基間的堆集力決定，堿基對(duì)G-C間含有3個(gè)雙鍵，G-C配對(duì)越多，解鏈所需溫度就越高[20]。耐熱微生物G-C堿基對(duì)含量為53.2%(常溫菌為44.9%)，同時(shí)耐熱微生物DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中核苷酸排列更有序，堿基堆集力更強(qiáng)，從而增加其對(duì)高溫的耐受力[21]。

tRNA在蛋白質(zhì)合成中起運(yùn)載作用。耐熱微生物tRNA具有很好的熱穩(wěn)定性，并且周轉(zhuǎn)速度快于常溫菌，有利于保護(hù)熱不穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物，使其可迅速合成[22]。

2 非發(fā)酵豆制品中蛋白質(zhì)對(duì)微生物耐熱性的影響

2.1 蛋白質(zhì)對(duì)微生物的保護(hù)作用

食品中蛋白質(zhì)對(duì)微生物細(xì)胞具有緩沖保護(hù)作用，岳青等[23]研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)可提高微生物的熱抵抗力，尤其是明膠、血清等能增加芽孢的耐熱性。陳健凱等[24]使用牛奶蛋白做包埋劑包埋乳酸菌，可使乳酸菌保持更高的存活率，具有更加穩(wěn)定的生物活性，耐酸耐高溫。Dave等[25]研究發(fā)現(xiàn)牛乳中添加半胱氨酸可顯著提高雙歧桿菌的存活率，乳清蛋白可促進(jìn)其存活。劉成梅等[26]研究認(rèn)為豆奶中蛋白質(zhì)可降低瞬時(shí)高壓協(xié)同加熱對(duì)嗜熱芽孢桿菌的殺滅效果，認(rèn)為在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)基質(zhì)濃度越高，對(duì)菌體的保護(hù)作用越強(qiáng)。Metric等[27]使用雞肉做培養(yǎng)基培養(yǎng)沙門氏菌，后將培養(yǎng)過(guò)的沙門氏菌暴露于高溫高壓環(huán)境中90min仍不能滅活，蛋白質(zhì)對(duì)微生物的保護(hù)作用可認(rèn)為蛋白質(zhì)生物大分子有機(jī)物可緩沖高溫高壓對(duì)微生物的傷害，同時(shí)蛋白質(zhì)作為微生物的培養(yǎng)基成分，能夠加速微生物的繁殖與自我復(fù)制[28]。

2.2 鹽橋與微生物耐熱性的關(guān)系

鹽橋，又稱離子鍵，是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中靜電作用的一種，在蛋白質(zhì)折疊、穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能方面有重要作用。豆腐形成過(guò)程中需在豆?jié){中加入氯化鈣溶液，鈣離子可屏蔽蛋白質(zhì)分子間的靜電力，同時(shí)可在帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)分子間形成鹽橋[29]。Remondteeo等[30]認(rèn)為鹽濃度與凝膠微觀結(jié)構(gòu)存在緊密關(guān)系，低鹽濃度范圍可誘導(dǎo)凝膠形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。隨著CaCl2濃度的增加，誘導(dǎo)生成的凝膠脆性、硬度都相應(yīng)增加[31]，凝膠脆性、硬度的增加可增強(qiáng)其對(duì)菌體的保護(hù)作用[32]。

當(dāng)帶相反電荷的兩個(gè)原子之間的距離小于4A時(shí)可形成鹽橋。當(dāng)3個(gè)以上帶電殘基側(cè)鏈基團(tuán)聚集到一起時(shí)形成鹽橋網(wǎng)絡(luò)或離子對(duì)網(wǎng)絡(luò)。丁彥蕊等[33]研究發(fā)現(xiàn)鹽橋數(shù)量和鹽橋網(wǎng)絡(luò)的數(shù)量和分布與微生物耐熱性有直接關(guān)系。提高總鹽橋含量和鹽橋網(wǎng)絡(luò)的比例可顯著提高微生物耐熱性，即鹽橋總含量和鹽橋網(wǎng)絡(luò)在總鹽橋中的比例與微生物耐熱性呈正相關(guān)。

2.3 膠體與微生物耐熱性的關(guān)系

膠體類物質(zhì)存在于豆腐中，由于膠體的存在使得豆?jié){凝結(jié)形成豆腐，并賦予豆腐致密有序的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。膠體類物質(zhì)在滅菌過(guò)程中對(duì)于微生物起到抵抗熱力致死的作用，能夠提高微生物的耐熱性，主要是由于膠體物質(zhì)可將菌體細(xì)胞嚴(yán)密包裹，起到包埋和保護(hù)菌體細(xì)胞的作用。

張強(qiáng)等[34]使用海藻酸鈉膠體包埋嗜熱鏈球菌，發(fā)現(xiàn)4%海藻酸鈉凝膠包埋乳酸菌可有效提高菌體的熱穩(wěn)定性和耐久存特性。張久龍等[35]通過(guò)鹽誘導(dǎo)乳清蛋白冷凝膠保護(hù)乳酸桿菌，發(fā)現(xiàn)菌體的耐熱性隨凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的致密性增加而提高。朱俊晨等[36]研究膠類物質(zhì)對(duì)青春雙歧桿菌穩(wěn)定性的影響，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)膠類物質(zhì)能夠增加菌體的穩(wěn)定性、耐熱耐酸性、貯存期延長(zhǎng)，說(shuō)明膠體物質(zhì)對(duì)菌體細(xì)胞有包埋及保護(hù)作用。

3 結(jié) 論

3.1 非發(fā)酵豆制品中微生物主要有芽孢桿菌，是耐熱性很強(qiáng)的微生物；此外，非發(fā)酵豆制品中食品基質(zhì)對(duì)微生物的保護(hù)也是導(dǎo)致微生物耐熱性的主要因素。

3.2 對(duì)非發(fā)酵豆制品采用高溫高壓殺菌是食品安全性的重要保證，但會(huì)使產(chǎn)品感官發(fā)生不良改變，影響消費(fèi)者對(duì)產(chǎn)品的可接受程度。

3.3 了解非發(fā)酵豆制品殺菌過(guò)程中微生物的耐熱機(jī)制，對(duì)完善非發(fā)酵豆制品殺菌工藝，延長(zhǎng)食品貨架期，提高食品食用安全性等方面都有重要意義。

[1] 趙文偉, 吳東根. 大豆的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與加工利用[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2007 (18): 126-127.

[2] 毛禮鐘, 毛昊. 大豆和大豆制品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與豆腐的新品種[J]. 中國(guó)烹飪研究, 1997(4): 40-43.

[3] 蘇繼穎. 大豆制品的營(yíng)養(yǎng)及發(fā)展趨勢(shì)[J]. 中國(guó)油脂, 2006(8): 40-41.

[4] 王敏, 檀建新, 路玲, 等. 非發(fā)酵豆制品主要腐敗菌的分離鑒定[J].中國(guó)釀造, 2006(6): 68-70.

[5] 汪立平, 張慶華, 趙勇, 等. 變質(zhì)豆?jié){中腐敗微生物的分離與初步鑒定[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2007, 34(4): 621-624.

[6] 沈萍. 微生物學(xué)[M]. 北京: 高等教育出版社, 2000.

[7] JAY J M. 現(xiàn)代食品微生物學(xué)[M]. 5版. 徐巖, 張繼民, 湯丹劍, 等,譯. 北京: 中國(guó)輕工業(yè)出版社, 2002.

[8] 曹利群, 葉磊, 張惟廣. 嗜熱微生物的耐熱機(jī)制及應(yīng)用[J]. 山東食品發(fā)酵, 2008(4): 24-26.

[9] 徐世榮, 陳驤, 吳云鵬. 細(xì)菌芽孢形成機(jī)制在微生態(tài)制劑生產(chǎn)中的應(yīng)用[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2007, 26(4): 121-126.

[10] SEN R, SWAMINATHAN T. Application of response surface methodology to evaluate the optimum environmental conditions for the enhanced production of surfactin[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 1997, 47 (4): 358-363.

[11] 雷梔, 賀新生. 芽孢耐熱機(jī)制探討[J]. 西南科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 19 (4): 90-95.

[12] 郝生宏, 董曉芳, 佟建明, 等. 不同飼料制粒條件和保存時(shí)間對(duì)益生菌活力的影響[J]. 動(dòng)物生產(chǎn), 2009, 45(1): 51-53.

[13] 周小鷺. 嗜熱菌及其嗜熱機(jī)制[J]. 林業(yè)科技情報(bào), 1996(3): 42-43.

[14] MELCHIOR D L. Lipid phase transitions and regulation of menbrane fluidity in prokaryotes[J]. Curr Top Membranes Transp, 1982, 17: 263-316.

[15] JAENICKI R. Stability of proteins in extreme environments: crystallins and enzymes[J]. FASEB, 1998, 8(6): 738-748.

[16] 盧柏松, 王國(guó)力, 黃培堂. 嗜熱與嗜常溫微生物的蛋白質(zhì)氨基酸組成比較[J]. 微生物學(xué)報(bào), 1998, 38(1): 20-25.

[17] 丁彥蕊, 蔡宇杰, 須文波. 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)屬性與全基因組微生物耐熱性的關(guān)系[J]. 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2007, 23(4): 323-330.

[18] WRAY J W, BAASE W A, LINDSTROM J D, et al. Structural analysis of a noncontiguous second-site revertant in T4 lysozyme shows that increasing the rigidity of a protein can enhance its stability[J]. J Mol Biol, 1999, 292(5): 1111-1120.

[19] PARTHASARATHY S, MURTHY M R. Protein thermal stability: insights from atomic displacement parameters (B values)[J]. Protein Eng, 2000, 13(1): 9-13.

[20] 馬挺, 劉如林. 嗜熱菌耐熱機(jī)理的研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2002, 29(2): 36-88.

[21] 酈惠燕, 邵靖宇. 嗜熱菌的耐熱分子機(jī)制[J]. 生命科學(xué), 2002, 12(1): 30-33.

[22] 阮靈偉. 嗜熱菌分子分類方法及適應(yīng)性機(jī)制的初步研究[D]. 廈門: 廈門大學(xué), 2006.

[23] 岳青, 李昌文. 罐頭食品殺菌時(shí)影響微生物耐熱性的因素[J]. 食品研究與開發(fā), 2007, 28(10): 173-175.

[24] 陳健凱, 翁文. 雙層包埋劑包埋乳酸菌[J]. 漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院院報(bào), 2005, 7(3): 5-8.

[25] DAVE R, SHAH N P. Viability of yoghurt and probiotic bacteria in yoghurt made from commercial starter culture[J]. Int Dairy J, 1997, 7(1): 31-41.

[26] 劉成梅, 鐘業(yè)俊, 劉偉, 等. 瞬時(shí)高壓對(duì)嗜熱脂肪芽孢桿菌的殺滅效果[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(9): 55-58.

[27] METRIC C, HOOVER D G, FARKAS D E. Effects of high hydrostatic pressure on heat-resistant and heat-sensitive strain of Salmonella[J]. 1989, 54(6): 1547-1564.

[28] 鐘業(yè)俊, 劉成梅, 劉偉, 等. 食品基質(zhì)成份對(duì)瞬時(shí)高壓殺滅枯草芽孢桿菌效果的影響[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2006, 22(3): 17-20.

[29] JU Zhiyong, KILARA A. Aggregation induced by calcium chloride and subsequent thermal gelation of whey protein isolate[J]. J Dairy Sci, 1998, 81(4): 925-931.

[30] REMONDTEEO G E, PAQUIN P, SUBIRADE M. Cold gelation of βlactoglobulin in the presence of iron[J]. Journal of Food Science, 2002, 67(2): 586-595.

[31] JU Zhiyong, KILARA A. Textural properties of cold-gels induced from heat-denatured whey protein isolates[J]. Journal of Food Science, 1998, 63(2): 288-292.

[32] BRYANT C M, MCCLEMENTS D J. Influence of nacland CaCl2 on cold-set gelation of heat-denatured whey protein[J]. Journal of Food Science, 2000, 65(5): 801-804.

[33] 丁彥蕊, 蔡宇杰, 孫俊, 等. 鹽橋與全基因組微生物耐熱性的關(guān)系研究[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 26(3): 335-339.

[34] 張強(qiáng), 馬齊, 徐升運(yùn), 等. 海藻酸鈉包埋乳酸菌及活性分析[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009(2): 23-25.

[35] 張久龍, 孟祥晨. 鹽誘導(dǎo)乳清蛋白冷凝膠對(duì)雙歧桿菌的保護(hù)作用[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào): 理學(xué)版, 2008, 43(7): 1-5.

[36] 朱俊晨, 李世敏, 林胄, 等. 膠類物質(zhì)對(duì)固體制劑中青春雙歧桿菌穩(wěn)定性研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2000, 27(6): 433-436.

Progress in the Research on Thermo-resistant Mechanisms of Microorganisms in Non-fermented Soybean Products

GUO Jia-jing，LI Zong-jun*，WANG Yuan-liang
(Hunan Province Key Laboratory of Food Science and Biotechnology, College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

The incomplete sterilization of non-fermented soybean products is an important factor for affecting the quality and safety of foods. In this paper, thermo-resistant mechanisms of microorganisms and the effect of non-fermented soybean product on the thermostability of microorganisms are discussed. Meanwhile, factors affecting the thermostability of microorganisms in non-fermented soybean products during sterilization process are explored.

non-fermented soybean products；thermo-resistant microorganism；thermo-resistant mechanism

TS201.3

A

1002-6630(2011)07-0332-03

2010-07-30

長(zhǎng)沙市重點(diǎn)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(K1001081-21)

郭佳婧(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：guojiajing1986@yahoo.com.cn

*通信作者：李宗軍(1967—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：lizongjun@yahoo.com.cn