詹志春 周 櫻 武漢新華揚(yáng)生物股份有限公司,武漢 430074
酶在中國飼料工業(yè)中的應(yīng)用已歷經(jīng)10多年歷史,目前為行業(yè)普遍接受。2009年中國飼用酶制產(chǎn)值已達(dá)6億元人民幣。除飼料工業(yè)領(lǐng)域外,能源、食品、環(huán)保等領(lǐng)域?qū)γ钢苿┑难芯颗c應(yīng)用方興未艾,預(yù)計(jì)2013年全球酶制劑市場(chǎng)產(chǎn)值將突破70億美元,酶制劑已成為生物工程及其交叉學(xué)科中最熱門的研究話題。
低碳經(jīng)濟(jì),是指在可持續(xù)發(fā)展理念指導(dǎo)下,通過技術(shù)創(chuàng)新、制度創(chuàng)新、產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型、新能源開發(fā)等多種手段,盡可能地減少煤炭石油等高碳能源消耗,減少溫室氣體和廢棄物的排放,達(dá)到經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展與生態(tài)環(huán)境保護(hù)雙贏的一種經(jīng)濟(jì)發(fā)展形態(tài)。
如何實(shí)現(xiàn)酶制劑在低碳經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)中的廣泛應(yīng)用,不僅是飼料行業(yè)關(guān)注的焦點(diǎn),更是人類實(shí)現(xiàn)綠色、低碳、可持續(xù)生存與發(fā)展的關(guān)鍵。
本文將就酶制劑在飼料工業(yè)、泛生物工業(yè)中對(duì)于實(shí)現(xiàn)綠色、無抗生產(chǎn)和緩解環(huán)境污染方面的應(yīng)用與未來發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行研究與報(bào)道。
β-甘露聚糖酶廣泛存在于動(dòng)物、植物(魔芋、萵苣等)和微生物中,是豆科植物細(xì)胞壁的主要組成成分。
β-甘露聚糖酶可將甘露聚糖降解為甘露低聚糖,其對(duì)畜禽的免疫系統(tǒng)有較好的調(diào)節(jié)作用,Savvage等(1996)報(bào)道,甘露寡糖能提高火雞粘膜IgA水平,并顯著提高血液中IgG含量,意味著甘露寡糖能同時(shí)提高與腸粘膜及體液免疫有關(guān)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。Zou等(2006)的研究表明,在肉雞飼料中添加β-甘露聚糖酶能增強(qiáng)機(jī)體的免疫機(jī)能,增加免疫器官指數(shù),顯著增加血清中IgM含量,促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖。
同時(shí),甘露低聚糖能夠調(diào)控動(dòng)物胃腸道的微生態(tài)環(huán)境,促進(jìn)有益菌繁殖、抑制有害菌在腸道上皮定植(圖1),從而維持正常的消化道微生態(tài)系統(tǒng)。
圖1 甘露寡糖抑制有害菌在腸道上皮定植
木聚糖普遍存在于植物性飼料原料的細(xì)胞壁中(表1),按其在水中的溶解程度分為水溶性和非水溶性兩種,是半纖維素中主要的結(jié)構(gòu)形式。
木聚糖酶可通過典型的酸堿親核水解反應(yīng)作用于飼料原料中的木聚糖,從而產(chǎn)生木糖或木寡糖(XOS,圖2)。木寡糖又稱為低聚木糖,是由2~7個(gè)木糖分子以β-1,4糖苷鍵結(jié)合而成的功能性聚合糖。木寡糖是畜禽腸道中雙歧桿菌的主要食物,因此可高度選擇性促進(jìn)雙歧桿菌的繁殖,而雙歧桿菌可促進(jìn)盲腸中丁酸的產(chǎn)生,從而進(jìn)一步促進(jìn)厭氧菌的增殖。而丁酸可減少沙門氏菌對(duì)腸道上皮細(xì)胞的侵襲及在盲腸與組織器官中的定植,從而改善腸道微生態(tài)區(qū)系,減少腹瀉等疾病的發(fā)生。
表1 常用飼料原料中木聚糖含量及類型
圖2 0.2μm電鏡下酶制劑對(duì)聚糖的降解效果
溶菌酶名稱起源于1922年,A1exander F1em ing發(fā)現(xiàn)人的唾液、眼淚中存在一種可溶解細(xì)菌細(xì)胞壁的酶,因其具有溶菌作用,就命名為溶菌酶。
一般人認(rèn)為,溶菌酶能切斷肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的β-1,4糖苷鍵,破壞肽聚糖支架,從而使細(xì)菌細(xì)胞在內(nèi)部滲透壓的作用下脹裂而死亡(B1ake CC,et a1.,1965)。
溶菌酶在飼料行業(yè)已取得一些應(yīng)用研究進(jìn)展。
Humphrey等 (2002)研究禽日糧抗生素替代品時(shí),發(fā)現(xiàn)老鼠表達(dá)人的乳鐵蛋白和溶菌酶飼喂雞時(shí)也有抗生素的作用:給Cobb肉雞飼喂176mg/kg飼料的溶菌酶,飼料效率相對(duì)對(duì)照組顯著提高(P<0.05),十二指腸絨毛高度增加,回腸固有層變薄,腸上皮及粘膜粒性白細(xì)胞減少,表明在肉雞日糧中溶菌酶可替代抗生素使用。
DR Brundige等(2008)報(bào)道,用轉(zhuǎn)基因羊產(chǎn)生的富含溶菌酶的奶每天2遍飼喂斷奶豬,結(jié)果發(fā)現(xiàn)溶菌酶可影響其生長(zhǎng)、腸上皮狀況及大腸桿菌數(shù)量。相對(duì)對(duì)照組,飼喂該奶6周的豬回腸大腸桿菌類顯著降低(P<0.029),腸道致病大腸桿菌數(shù)量也顯著降低 (P<0.030)。 同時(shí)腸絨毛寬度增加 (P<0.029),每微米高度絨毛的上皮淋巴細(xì)胞減少(P<0.020)。結(jié)果表明,飼喂溶菌酶可改善豬腸道健康,抵抗致病性大腸桿菌 (EPEC)。E1izabeth A.等(2006)研究發(fā)現(xiàn)溶菌酶對(duì)豬也有類似的效果。
溶菌酶除具備類似抗生素常規(guī)的抗微生物活性外,還可抗不同的病毒:如抗HIV-1(Le-Huang S,et a1,1999),Oevermann(2003) 體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)溶菌酶可有效抗HSV-1(單純皰疹病毒)、副流感病毒3型及豬呼吸道冠狀病毒。張繡(2007)等發(fā)現(xiàn)來源于海洋微生物的溶菌酶可抗豬偽狂犬病毒。
噬菌體用于抗菌治療和預(yù)防細(xì)菌感染的研究已有較長(zhǎng)的歷史,在抗生素發(fā)現(xiàn)和廣泛使用之前,人們就設(shè)想運(yùn)用噬菌體來治療細(xì)菌感染。但是許多因素阻礙了噬菌體治療的研究和發(fā)展,尤其是抗生素的發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移了人們對(duì)噬菌體治療研究的興趣,忽略了對(duì)噬菌體治療的正確認(rèn)識(shí)。隨著致病菌對(duì)大多數(shù)抗生素產(chǎn)生抗性,細(xì)菌的耐藥性已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的一個(gè)非常嚴(yán)峻的問題,人類正重新進(jìn)入“后抗生素”時(shí)代,亟需發(fā)展非抗生素類抗感染藥物。噬菌體裂解酶是噬菌體在感染細(xì)菌后期表達(dá)的一類細(xì)胞壁水解酶。該酶通過水解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖上糖與肽間的酰胺鍵或肽內(nèi)氨基酸殘基間的連接鍵而使細(xì)菌裂解,從而釋放出子代噬菌體用于感染其他細(xì)菌。
與抗生素相比:①噬菌體裂解酶作用只針對(duì)特異宿主菌的細(xì)胞壁,專一性強(qiáng),因而作用可集中在感染部位;抗生素則是通過干擾和破壞細(xì)菌的新陳代謝而抑制和殺滅細(xì)菌,最終被排出體外,不能集中在感染部位;②噬菌體裂解酶具有高度的特異性,只破壞目標(biāo)菌而不影響正常菌群,噬菌體裂解酶用于預(yù)防和治療動(dòng)物的細(xì)菌感染的研究未發(fā)現(xiàn)有嚴(yán)重的副反應(yīng);抗生素在殺滅病原微生物的同時(shí)也破壞機(jī)體內(nèi)的有益菌群,從而很可能破壞機(jī)體的菌群平衡,抗生素的使用經(jīng)常出現(xiàn)多種不良反應(yīng),包括胃腸功能障礙、過敏反應(yīng)及二次感染等;③一種噬菌體耐受的細(xì)菌對(duì)具有類似宿主范圍的其它噬菌體仍保持敏感;細(xì)菌性抗生素的耐受則不局限于目標(biāo)菌群,因而一種抗生素就可能造成很多耐藥菌群。隨著抗生素應(yīng)用的日益廣泛,細(xì)菌對(duì)一些常用的藥物已呈現(xiàn)不同程度的耐藥性;④研制開發(fā)新的噬菌體裂解酶來裂解耐受菌株相對(duì)開發(fā)新的抗生素周期短、成本低,自然界中幾乎所有的細(xì)菌都有相應(yīng)的噬菌體,因而,噬菌體裂解酶的開發(fā)研究具有重要的價(jià)值。
2009年《自然免疫學(xué)》雜志中報(bào)道了一種新型酶制劑--泛素化酶Nrdp1,該酶能夠直接結(jié)合在免疫識(shí)別與免疫調(diào)節(jié)中起重要作用的兩個(gè)信號(hào)分子(MyD88和TBK1)上,通過不同位點(diǎn)介導(dǎo)的泛素化過程促進(jìn)MyD88降解而激活TBK1,從而抑制了MyD88信號(hào)通路觸發(fā)巨噬細(xì)胞等炎癥性細(xì)胞因子產(chǎn)生,促進(jìn)TBK1信號(hào)通路觸發(fā)的Ⅰ型干擾素產(chǎn)生,從而實(shí)現(xiàn)抑制炎癥性細(xì)胞因子的產(chǎn)生,幫助機(jī)體有效清除病毒感染并減弱炎癥損害。
動(dòng)物集約化養(yǎng)殖體系對(duì)環(huán)境造成的污染是當(dāng)今農(nóng)業(yè)面臨的主要問題,而磷污染是其中一個(gè)主要的方面。據(jù)推算,全國每年僅養(yǎng)豬業(yè)就向環(huán)境中排泄150萬噸左右的磷。過量的磷流人土壤后,會(huì)被土壤顆粒吸收,最終污染地表水。此外,水產(chǎn)養(yǎng)殖中由于向水體中投喂大量的飼料,從而大量殘餌和未被消化吸收的磷溶解于水中,造成水體磷污染。
日糧中添加植酸酶可提高植酸磷的利用率,有效降低外源磷的添加量,從而減少磷的過剩排泄和對(duì)環(huán)境的污染。目前植酸酶已在畜禽飼料中廣泛應(yīng)用。但由于消化道生理特性及飼料加工特點(diǎn),水產(chǎn)飼料中并未規(guī)?;褂弥菜崦浮?/p>
新華揚(yáng)技術(shù)中心與武漢工業(yè)學(xué)院2008年研究表明:飼料中使用1.5%磷酸二氫鈣為對(duì)照組,在此基礎(chǔ)上添加中性耐溫植酸酶500和1000HYU/kg分別為試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅳ組,降低磷酸二氫鈣的水平為0.75%,再添加中性耐溫植酸酶500和1000HYU/kg分別為試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅲ組,在調(diào)質(zhì)、制粒溫度85℃左右的條件下制作試驗(yàn)飼料,飼養(yǎng)27g大小的青魚77d后,結(jié)果顯示,試驗(yàn)Ⅱ組和Ⅳ組青魚的增重率顯著大于對(duì)照組(P<0.05),飼料系數(shù)小于對(duì)照組,但差異不顯著(P>0.05);當(dāng)降低配合飼料中的磷酸二氫鈣配比時(shí),添加中性耐溫植酸酶的試驗(yàn)Ⅰ組和Ⅲ組青魚增重率大于對(duì)照組(P>0.05);添加中性耐溫植酸酶各試驗(yàn)組青魚對(duì)飼料干物質(zhì)和磷的表觀消化率均大于對(duì)照組。這些結(jié)果說明,飼料中添加中性耐溫植酸酶500~1000HYU/Kg可有效促進(jìn)青魚的生長(zhǎng),提高青魚對(duì)飼料的消化吸收。本試驗(yàn)結(jié)果還說明使用中性耐溫植酸酶可使飼料磷酸二氫鈣的用量降低0.75%而不影響青魚的生長(zhǎng)。
新華揚(yáng)技術(shù)中心2009年研究表明,以初始體重(31.45±4.68)g的草魚為研究對(duì)象,在大豆粕、菜籽粕和棉粕為主要蛋白源的飼料中,用同一水平(500U/kg)的中性植酸酶梯度替代基礎(chǔ)飼料中2.0%的磷酸二氫鈣,替代水平分別為25%(P25)、50%(P50)和75%(P75),研究草魚生長(zhǎng)、魚體組成和血液生化指標(biāo)的變化,以期獲得中性植酸酶對(duì)磷酸二氫鈣的適宜替代量。9周的試驗(yàn)結(jié)果顯示,各替代組的增重率、特定生長(zhǎng)率、餌料系數(shù)和成活率除P75外都與對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)。全魚組成成分中粗蛋白含量,P25、P50與對(duì)照組相比無顯著性差異(P>0.05),但有上升趨勢(shì);粗脂肪含量P25顯著性低于對(duì)照組(P<0.05),P50與對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)。 血樣分析顯示,P25、P50和 P75的堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性都顯著性高于對(duì)照組(P<0.05),且P50最高;血磷、血鈣含量與對(duì)照組相比有上升趨勢(shì),且替代組的血鈣含量都顯著性高于對(duì)照組(P<0.05)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,飼料中加入500U/kg的中性植酸酶,磷酸二氫鈣的添加量可減少0.5%~1%,即每噸飼料中加入0.2kg的中性植酸酶,可減少5~10kg的磷酸二氫鈣。
同時(shí),試驗(yàn)表明,日糧中添加植酸酶,可降低向水體中排放的磷含量10%~35%。
隨著養(yǎng)殖業(yè)集約化的發(fā)展,養(yǎng)殖業(yè)所產(chǎn)生的氮污染越來越嚴(yán)重,而且凈化氮污染的難度大、費(fèi)用高。因此,集約化養(yǎng)殖場(chǎng)附近糞養(yǎng)分往往過度承載,已經(jīng)成為制約養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸。隨糞尿排出的磷對(duì)環(huán)境的污染已成為全球性問題之一。解決氮的過量排泄,以盡量減少養(yǎng)分浪費(fèi)、降低養(yǎng)殖業(yè)生態(tài)環(huán)境的破壞是養(yǎng)殖業(yè)所面臨的重大課題。
萬振環(huán)、咼于明(2009)研究表明,以對(duì)照組日糧、低氮日糧和低氮加酶日糧飼喂1日齡愛拔益加肉仔雞,試驗(yàn)表明,低氮日糧導(dǎo)致雛禽生長(zhǎng)性能顯著下降,但添加酶制劑可改善其生產(chǎn)性能和綜合生產(chǎn)指數(shù),顯著降低糞便中氮的排放量。
(1)鹵醇脫鹵酶對(duì)化學(xué)制劑、農(nóng)藥廢水的處理
隨著化工業(yè)的飛速發(fā)展,以及人們對(duì)化學(xué)制劑及農(nóng)藥的廣泛使用和不正當(dāng)?shù)墓I(yè)排廢,有機(jī)鹵化物污染土壤及水源的現(xiàn)象日趨普遍,其對(duì)環(huán)境及人類健康造成的危害也日趨嚴(yán)重。這類異生質(zhì)鹵化物往往自降解能力很差,同時(shí)許多該類化合物是疑似致癌或高誘變物質(zhì)。傳統(tǒng)的物理化學(xué)治理方法容易造成二次污染,因此,應(yīng)用微生物降解有機(jī)鹵化物已成為研究熱點(diǎn)。國內(nèi)外多個(gè)研究機(jī)構(gòu)已經(jīng)成功地篩選到多種可以降解有機(jī)鹵化物的微生物菌株,其催化碳鹵鍵斷裂的機(jī)制各不相同,如以鹵代烷烴脫鹵酶和鹵酸脫鹵酶為代表的水解脫鹵、還原脫鹵酶通過還原反應(yīng)脫鹵、通過水合作用脫鹵等,已有多篇綜述報(bào)道。新近研究的鹵醇脫鹵酶具有不同于上述脫鹵酶的反應(yīng)機(jī)理,它們通過分子內(nèi)親和取代機(jī)制進(jìn)行脫鹵。
目前,國內(nèi)對(duì)鹵醇脫鹵酶的研究還未見報(bào)道。后期,在借鑒國外對(duì)已有鹵醇脫鹵酶進(jìn)行研究的同時(shí),應(yīng)用宏基因組技術(shù)進(jìn)行新酶的挖掘也將是研究的熱點(diǎn)。盡管目前對(duì)該類酶的研究還處于起步階段,但毋庸置疑的是,鹵醇脫鹵酶必將在制備精細(xì)化工品與手性藥品的綠色化學(xué)通路中扮演越來越重要的角色。
(2)過氧化物酶對(duì)酚類廢水的處理
酚類化合物是常見的有毒有機(jī)污染物,含酚廢水主要來自焦化廠、樹脂廠、塑料廠、合成纖維廠、煤氣廠、石油化工廠、絕緣材料廠等工業(yè)部門以及石油裂解制造乙烯、合成苯酚、聚酰胺纖維、合成染料、有機(jī)農(nóng)藥和酚醛樹脂的生產(chǎn)過程,它是水體的重要污染物之一。含酚廢水在我國水污染控制中被列為重點(diǎn)解決的有害廢水之一,它的大量排放對(duì)水體、土壤造成嚴(yán)重的污染,進(jìn)而危害人類的健康。因此,用酶的催化聚合作用來處理酚類及芳香胺類化合物的污染已經(jīng)引起了國內(nèi)外學(xué)者的普遍興趣。由于過氧化物酶能催化H2O2氧化酚類、芳香胺類物質(zhì)的聚合反應(yīng),具有反應(yīng)條件溫和、選擇性高、催化效率高的優(yōu)點(diǎn)。所以在含酚廢水處理方面有著潛在的應(yīng)用前景,近年來越來越引起人們的重視。
80年代中期,K1ibanov等人通過研究發(fā)現(xiàn)了辣根過氧化物酶能處理氯酚和苯胺,這類酶整個(gè)反應(yīng)過程和以往的酶處理反應(yīng)過程不同,先是酶反應(yīng),接著是化學(xué)反應(yīng),克服了酶反應(yīng)中基質(zhì)特異性的限制,用一種酶可以處理廢水中多種含羥基的芳香族化合物。
利用過氧化物酶的催化氧化作用來處理酚類、芳香胺類、染料類廢水的污染是近年來受到重視的新方法,降解的結(jié)果有效地降低了有毒有機(jī)污染物的含量,同時(shí)也降低了毒性,是一種很有潛力的廢水處理方法;但有機(jī)合成通常是在高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高離子強(qiáng)度、有機(jī)溶劑等環(huán)境中進(jìn)行,在這些極端條件下酶穩(wěn)定性差,易失活,同時(shí)過氧化物酶本身是水溶性的,而且反應(yīng)后混入催化產(chǎn)物等物質(zhì)使純化困難,不能重復(fù)使用。因而使用固定化酶技術(shù),必然會(huì)降低處理廢水的成本,提高酶的使用效果,也必然會(huì)受到越來越多人的關(guān)注,在工業(yè)生產(chǎn)的各個(gè)方面具有極大的推廣價(jià)值。
2.4 有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶的應(yīng)用
有機(jī)磷農(nóng)藥作為一類高效廣譜的殺蟲劑自上世紀(jì)40年代發(fā)明以來,已在全世界范圍內(nèi)大量生產(chǎn)并大面積使用。有機(jī)磷農(nóng)藥大大提高農(nóng)作物的產(chǎn)量,是農(nóng)業(yè)豐收的保證,為人類社會(huì)發(fā)展做出了重要的貢獻(xiàn)。但隨著有機(jī)磷農(nóng)藥長(zhǎng)期和大范圍的使用,越來越多的環(huán)境問題、人類健康問題、人類可持續(xù)發(fā)展問題日益凸顯出來,已經(jīng)引起社會(huì)的廣泛關(guān)注。
為保護(hù)生態(tài)環(huán)境和人類健康,科研工作者們一直在尋找各種辦法消除有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的污染。傳統(tǒng)的方法是采用化學(xué)法或焚燒、掩埋,而這些方法副作用大,往往造成環(huán)境的二次污染,且作用緩慢。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,大量研究表明土壤和水環(huán)境中的微生物可以分泌一種能水解磷酸酯鍵的酶--有機(jī)磷降解酶。有機(jī)磷降解酶又稱磷酸三酯酶,可降解有機(jī)磷農(nóng)藥分子,破壞有機(jī)磷化合物分子和一些軍用神經(jīng)毒劑如沙林的磷酯鍵而使其脫毒。由于有機(jī)磷農(nóng)藥都有類似的結(jié)構(gòu),只是取代基不同,所以一種有機(jī)磷降解酶往往可以降解多種有機(jī)磷農(nóng)藥。
除降解有機(jī)磷農(nóng)藥外,有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶還具有以下作用:
(1)環(huán)境污染監(jiān)測(cè)。有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶制劑可以水解廣泛的有機(jī)磷化合物,釋放出容易檢測(cè)的硝基酚、氟化物或氫離子,快速、敏感、有選擇性地直接檢測(cè)有機(jī)磷化合物。
(2)有機(jī)磷污染物的脫毒。固定化有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶制劑,制成的酶反應(yīng)器已用于用于污水處理中,可以重復(fù)使用,而且避免極端條件下酶變性,用于土壤異位修復(fù)中可避免土壤吸附、失活以及水解蛋白的微生物降解。
(3)醫(yī)療中應(yīng)用有機(jī)磷神經(jīng)毒劑索曼(soman)、沙林(sarin)等都含有磷酸三酯鍵,而磷酸三酯鍵斷裂后,很大程度上降低了有機(jī)磷的毒性,所以有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶制劑可開發(fā)作為有機(jī)磷中毒的解毒劑或預(yù)防劑,以消除有機(jī)磷神經(jīng)毒劑對(duì)人體的傷害。
自然界中,微生物的生命力最為強(qiáng)大。
未來幾十年,隨著世界人口的增長(zhǎng),農(nóng)業(yè)將經(jīng)歷具有重大意義的革新。毫無疑問,生物技術(shù)作為科學(xué)和技術(shù)在這場(chǎng)變革中將起到關(guān)鍵性的作用。酶制劑等生物技術(shù)的應(yīng)用,將推動(dòng)著畜牧業(yè)、飼料工業(yè)的無抗化、去污染化發(fā)展,推動(dòng)著國民經(jīng)濟(jì)實(shí)現(xiàn)低碳、環(huán)保與可持續(xù)進(jìn)步。
(略)