馮振軍，趙春亭，李光耀

(1青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東青島266003;2青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院;3聊城市人民醫(yī)院)

TOLL樣受體(TLRs)是人體內(nèi)天然免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞跨膜受體，也是原模式的識(shí)別受體，TOLL樣受體通過(guò)識(shí)別病原微生物的特殊結(jié)構(gòu)來(lái)迅速激活天然免疫，誘導(dǎo)獲得性免疫的產(chǎn)生［1，2］。其中 TLR4 在膿毒血癥中的表達(dá)已有較多報(bào)道，多認(rèn)為T(mén)LR4表達(dá)與膿毒血癥的病原識(shí)別、抗炎免疫信號(hào)啟動(dòng)及轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)，同時(shí)介導(dǎo)了組織損害。2009年11月～2011年3月，我們檢測(cè)了45例惡性血液病患者不同菌種感染后TOLL樣受體4(TLR4)的表達(dá)，探討TLR4對(duì)惡性血液病臨床感染的診斷意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 45例惡性血液病感染患者(觀察組，化療后處于緩解期)男31例，女14例;年齡21～78歲。其中淋巴瘤18例，骨髓瘤27例。感染部位:肺部感染19例，肛周感染8例，腸道感染8例，口腔感染10例。惡性血液病均符合《血液病診斷與療效標(biāo)準(zhǔn)》［3］;感染條件:有感染癥狀、體征，體溫＞38℃超過(guò)2 h。血培養(yǎng)或分泌物(尿及大便)分離出病原微生物或血液中檢測(cè)到病原體的抗原物質(zhì)。觀察組革蘭陰性菌感染16例，革蘭陽(yáng)性菌感染9例，真菌感染4例。選取查體健康者5例(對(duì)照組)，兩組一般資料有可比性。

1.2 血清TLR4檢測(cè) 兩組均取外周血，EDTA-K2抗凝，4℃冰箱保存待檢。檢測(cè)時(shí)均取100 μl標(biāo)本加入到20 μl抗體組合為CD14-FITC/TLR4-PE的專用流式試管中。混勻，室溫避光孵育20min。加2 ml溶血素，室溫避光孵育10min，1 500 r/min離心5min，倒去上清，加入2 ml緩沖液洗滌，1 500 r/min離心5min，去上清，加入100 μl沖液。上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以CD14及TLR-4抗體染色雙陽(yáng)性細(xì)胞百分率記錄結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)均以±s表達(dá)，兩組均數(shù)比較用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

對(duì)照組TLR-4陽(yáng)性率為41.2% ±0.8%。不同致病菌感染者TLR-4的表達(dá):革蘭陰性菌、陽(yáng)性菌及真菌感染者陽(yáng)性率分別為 70.4% ±2.5%、41.2% ±1.3%、40.5% ±2.0%，革蘭陰性菌感染者與對(duì)照組及其他菌種感染者比較，P均＜0.05。不同感染部位TLR-4的表達(dá):肺部、肛周、腸道、口腔部位感染者TLR-4陽(yáng)性率分別為62.2% ±11.3%、49.7% ±2.5%、50.1% ±2.9%、46.9% ±2.3%，以肺部感染者陽(yáng)性率最高，與對(duì)照組相比，T=－4.081，P=0.001;而口腔、肛周與腸道感染者TLR-4水平無(wú)顯著差異。革蘭陰性菌感染者治療前TLR4陽(yáng)性率為70.4% ±2.5%，體溫控制3、7 d后T分別為62.3% ± 3.3%、44.9% ± 1.5%，治療前后比較，P 均 ＜0.01。

3 討論

惡性血液病患者感染發(fā)生率高，確定致病微生物對(duì)指導(dǎo)臨床治療有重要意義。病原相關(guān)分子模式(PAMP)是病原對(duì)人體致病的重要分子結(jié)構(gòu)，通常是一定類別病原微生物所共有的、高度保守的分子結(jié)構(gòu)。研究證實(shí)，病原相關(guān)分子模式的特征:①為一定病原微生物所特有，區(qū)別于其他微生物結(jié)構(gòu);②為微生物在人體內(nèi)生存和致病所必需;③為宿主泛特異性識(shí)別的分子基礎(chǔ)。而在人體對(duì)PAMP識(shí)別的、分子結(jié)構(gòu)為T(mén)OLL樣受體(TLRs)，是一類固有免疫系統(tǒng)中跨膜受體，TOLL樣受體主要在固有性免疫系統(tǒng)細(xì)胞表面表達(dá)，如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等?，F(xiàn)有研究已經(jīng)證實(shí)，TRL4在機(jī)體抵抗革蘭陰性菌入侵的先天免疫中有重要作用。細(xì)菌內(nèi)毒素/脂多糖(LPS)是革蘭陰性菌的主要致病結(jié)構(gòu)及分子基礎(chǔ)。

LPS位于革蘭陰性菌細(xì)胞壁的外層，包括三個(gè)部分，即O特異性鏈、核心多糖和類脂A。其毒性部分是類脂A，與細(xì)菌致病有關(guān)。LPS作用人體的生物學(xué)效應(yīng)包括:①與機(jī)體組織結(jié)合直接導(dǎo)致細(xì)胞損傷，刺激單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)等釋放炎性介質(zhì)、酶等;②作用于凝血、纖溶系統(tǒng)激發(fā)播散性凝血;③可激活補(bǔ)體和B細(xì)胞;④發(fā)熱、休克、致耐藥性和致死性等。研究認(rèn)為，革蘭陰性細(xì)菌在進(jìn)行活體繁殖或崩解時(shí)可釋放內(nèi)毒素或LPS［6］，從而引起全身毒性反應(yīng)。在機(jī)體內(nèi)，LPS介導(dǎo)的免疫信號(hào)的激活需要血漿或細(xì)胞表面和內(nèi)毒素結(jié)合的蛋白作為載體，而TRL4正是介導(dǎo)人體內(nèi)LPS誘導(dǎo)免疫細(xì)胞激活的敏感受體。LPS通過(guò)一定途徑進(jìn)入人體后，首先進(jìn)入血循環(huán)，與血漿的LPS結(jié)合蛋白(LBP)識(shí)別并結(jié)合，之后再結(jié)合于單核等介質(zhì)細(xì)胞表面的CD14分子［7］。CD14通過(guò) GPI錨定于單核細(xì)胞膜。LPS以LPS2-LBP2-CD14形式的三體復(fù)合物活化TLR4信號(hào)傳導(dǎo)。結(jié)合于TLR4胞外區(qū)的MD22是一種可溶性蛋白分子，通過(guò)與TLR4結(jié)合來(lái)提高對(duì)LPS的敏感性，并可增加結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，TLR4基因缺失鼠分離的巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞對(duì)LPS低敏，說(shuō)明LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)需要TLR4的參與;轉(zhuǎn)染人類TLR4基因的293細(xì)胞，可以被LPS2CD14呈劑量及時(shí)間依賴性活化，引起NF2κB及其控制的相關(guān)基因的激活和表達(dá)［8］。

根據(jù)以上作用模式，現(xiàn)代免疫學(xué)認(rèn)為，TLR4是人體內(nèi)LPS作用的優(yōu)先受體，TLR4作為細(xì)胞膜上LPS的信號(hào)成分參與LPS的細(xì)胞激活，并可介導(dǎo)LPS對(duì)人體的免疫損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，惡性血液病患者TLR4的基礎(chǔ)水平與健康人并無(wú)區(qū)別，認(rèn)為盡管此類患者存在免疫功能缺陷，臨床上對(duì)感染易感，但在病原微生物的識(shí)別上與免疫功能正常的人群無(wú)顯著差異，其免疫功能降低可能存在于免疫信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)或效應(yīng)階段。本研究亦發(fā)現(xiàn)，革蘭陰性菌感染者TLR4陽(yáng)性率明顯升高，而在臨床抗感染治療好轉(zhuǎn)后，其TLR4的表達(dá)又明顯下降，說(shuō)明TLR4的表達(dá)與革蘭陰性菌感染密切相關(guān)。TLR4的檢測(cè)對(duì)革蘭陰性菌感染具有一定的判定意義。LPS對(duì)各種細(xì)胞TLR4表達(dá)的影響與作用時(shí)間和作用濃度有關(guān)，并有種系特異性和組織細(xì)胞特異性，作用機(jī)制可能比較復(fù)雜。但是可以看出LPS對(duì)TLR4表達(dá)的影響以上調(diào)為主。本研究革蘭陰性菌感染者，TLR4的表達(dá)出現(xiàn)明顯上調(diào)，屬于機(jī)體對(duì)外界感染的防御性機(jī)制。

TLR4的表達(dá)和功能對(duì)機(jī)體的天然免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)在感染的控制具有重要作用。TLR4表達(dá)的調(diào)節(jié)可能是一把雙刃劍，一方面其在宿主抵御微生物入侵方面有重要作用，作為感受器在病原入侵時(shí)激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng);另一方面其作為機(jī)體內(nèi)源性毒性信號(hào)的受體，可進(jìn)一步導(dǎo)致組織損害。本研究肺部感染患者TLR4陽(yáng)性率顯著升高，臨床感染癥狀相對(duì)較重，抗感染效果較差，恢復(fù)時(shí)間較長(zhǎng)，說(shuō)明重癥革蘭陰性菌感染病例可能已經(jīng)合并嚴(yán)重的內(nèi)毒素血癥，機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能出現(xiàn)紊亂，TLR4表達(dá)上調(diào)對(duì)其抗感染免疫起了負(fù)面作用。

綜上所述，TLR4在惡性血液病革蘭陰性菌感染，尤其是肺部感染時(shí)廣泛表達(dá)，對(duì)臨床診斷有一定參考價(jià)值。

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