許 鵬，黃 強(qiáng)，劉臣海，謝 放，邵 峰

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院，合肥 230001)

膽管癌是消化系統(tǒng)中預(yù)后很差的腫瘤，由于其特殊的解剖部位，早期不易發(fā)現(xiàn)，手術(shù)根治率低，目前缺乏有效的早期診斷方法。Survivin蛋白為新近發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［1］，參與調(diào)控內(nèi)源性和外源性凋亡路徑［2］;Caspase-3為細(xì)胞凋亡通路的關(guān)鍵蛋白，Survivin對Caspase-3活性有抑制作用。2005年1月～2007年12月，我們檢測了Survivin蛋白和Caspase-3蛋白在膽管癌和膽管癌癌旁正常膽管組織中的表達(dá)情況，探討Survivin和Caspase-3蛋白表達(dá)與膽管癌患者的臨床特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 手術(shù)切除的膽管癌標(biāo)本57份(膽管癌組)及癌旁正常膽管組織23份(對照組)，所有患者術(shù)前均未做放療、化療等抗腫瘤治療。57例膽管癌患者中男33例，女24例;年齡36～80歲，中位年齡59歲;組織學(xué)分型和分化程度依據(jù)2000年世界衛(wèi)生組織(WHO)標(biāo)準(zhǔn)，其中高分化8例，中分化32例，低分化17例;TNM分期按1997年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)制定的標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰ期9例，Ⅱ期13例，Ⅲ期15例，Ⅳ期20例。

1.2 Survivin、Caspase-3 蛋白表達(dá)檢測 兔抗人Survivin，Caspase-3多克隆抗體購買于美國Bioworld生物公司;過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素染色試劑盒(SP-9001)購買于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。所有的手術(shù)標(biāo)本均常規(guī)經(jīng)10%甲醛固定、石蠟包埋，連續(xù)4 μm切片。組織切片于90℃烤箱中烘烤10 min，二甲苯、梯度乙醇脫蠟;3%過氧化氫5 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性;將載玻片浸泡于0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH=6.0)中，微波修復(fù)抗原10 min;10%正常山羊血清工作液封閉;滴加稀釋的兔抗人 Survivin抗體(稀釋比1∶100)、Caspase-3抗體(稀釋比1∶100)，4℃孵育過夜;滴加生物素化標(biāo)記山羊抗兔IgG工作液37℃反應(yīng)1 h;滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液37℃反應(yīng)1 h;然后DAB顯色4 min，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核、脫水，中性樹脂封片固定，觀察實驗結(jié)果。將已知肺癌組織陽性切片結(jié)果作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。評分標(biāo)準(zhǔn):Survivin和 Caspase-3陽性表達(dá)主要表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核有棕黃色或棕褐色顆粒沉淀。每張載玻片隨機(jī)選用五個光學(xué)顯微鏡下(400×)視野，觀察染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分率，染色強(qiáng)度:無染色為0分，弱染色為1分，中染色為2分，強(qiáng)染色為3分。陽性細(xì)胞百分率評分:＜5%為0分;5% ～24%為1分;25% ～49%為2分;50% ～75%為3分;＞75%為4分。每張載玻片由2名高級職稱病理醫(yī)師評分，兩項評分的乘積0分為陰性，1～3分為(+)，4～6分為(++)，7～12分為(+++)。其中(+)～(+++)為Survivin和Caspase-3蛋白陽性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。率的比較采用χ2檢驗;相關(guān)性分析運行Spearman相關(guān)性檢驗;運用Kaplan-Meier曲線法Long-rank檢驗和建立Cox比例風(fēng)險模型進(jìn)行生存分析。所有檢驗均為雙側(cè)概率檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Survivin和Caspase-3蛋白表達(dá) 膽管癌組與對照組Survivin蛋白表達(dá)的陽性率分別為64.9%(37/57)、17.4%(4/23)，Caspase-3 的陽性率分別為 42.1%(24/57)、73.9%(17/23)，P 均 ＜ 0.05。Spearman相關(guān)性分析表明，Survivin和Caspase-3蛋白在膽管癌組織中存在負(fù)相關(guān)(r=－0.415，P=0.001)。

2.2 Survivin、Caspase-3蛋白表達(dá)與膽管癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表1。

表1 Survivin、Caspase-3蛋白表達(dá)與膽管癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 Survivin和Caspase-3蛋白表達(dá)與生存期 膽管癌組總體生存時間在3～57個月，中位生存時間26個月。Survivin陽性表達(dá)者生存時間明顯短于Survivin陰性表達(dá)者 (long Rank=16.535，P=0.000)，Caspase-3陽性表達(dá)者生存時間明顯長于Caspase-3 陰性表達(dá)者(long Rank=31.629，P=0.000);Cox回歸模型分析表明Survivin表達(dá)是膽管癌患者預(yù)后的獨立影響因子(HR=5.870，P=0.020)。

3 討論

膽管癌近年來發(fā)病率呈上升趨勢，治療效果差，5年生存率為9% ～40%［3］。腫瘤抑制基因的失活或原癌基因的激活是腫瘤發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。

Survivin作為凋亡抑制蛋白(IAP)的成員，有報道其參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，與腫瘤血管的生成、凋亡等密切相關(guān)［4］，在許多腫瘤均有表達(dá)，如乳腺癌、肺癌、前列腺癌等［5］。本研究發(fā)現(xiàn)，Survivin蛋白在膽管癌組織中表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，與泰興雷等［6］報道一致。Survivin蛋白表達(dá)與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)。表明Survivin表達(dá)可促進(jìn)膽管癌的發(fā)生、發(fā)展，作為膽管癌惡性程度評價的指標(biāo)。Survivin蛋白的作用可能通過Casepase家族抑制凋亡［7］;此外還可能通過制細(xì)胞色素C的釋放在線粒體水平參與抗凋亡［8］。

在細(xì)胞凋亡調(diào)控中關(guān)鍵家族是Caspase家族，Caspase-3則是Caspase凋亡通路的關(guān)鍵蛋白［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-3在膽管癌組織中陽性表達(dá)率明顯低于癌旁正常組織;Caspase-3表達(dá)與膽管癌患者的分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，膽管癌分化程度越低、TNM分期級別越高，Caspase-3表達(dá)率越低;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移膽管癌患者中，Caspase-3表達(dá)較低。即Caspase-3表達(dá)缺失可促進(jìn)膽管癌的惡性轉(zhuǎn)化。

目前分析Survivn和Caspase-3蛋白表達(dá)的關(guān)系在許多腫瘤中已有相關(guān)的研究，Survivn蛋白對Caspase凋亡通路具有調(diào)控抑制作用，黃建民等［10］在喉鱗癌組織發(fā)現(xiàn)Survivn和Caspase-3蛋白存在負(fù)性相關(guān)，在肝癌和胃癌的研究中亦有同樣發(fā)現(xiàn)［11，12］;研究表明 Survivn 基因通過對 Caspase-3 的調(diào)控影響細(xì)胞凋亡［13，14］。本研究發(fā)現(xiàn)，膽管癌組37例Survivin蛋白陽性表達(dá)中有10例Caspases-3蛋白亦為陽性，Spearman相關(guān)性分析表明Survivin和Caspase-3蛋白在膽管組織中存在負(fù)性相關(guān)，提示Survivn對Caspase-3蛋白的表達(dá)存在調(diào)控作用。具體的相關(guān)可能機(jī)制有待于通過分子生物學(xué)方法進(jìn)一步探討。

本研究發(fā)現(xiàn)，Survivn陽性表達(dá)者總體生存時間明顯短于Survivn陰性表達(dá)者;而Caspase-3陽性表達(dá)者生存時間明顯長于Caspase-3陰性表達(dá)者。證實Survivn過表達(dá)和Caspase-3低表達(dá)者預(yù)后較差。其機(jī)制可能為Survivn蛋白對腫瘤血管生長有促進(jìn)作用，同時通過調(diào)控凋亡路徑抑制腫瘤的細(xì)胞凋亡。Cox回歸風(fēng)險比例模型顯示，Survivin蛋白是膽管癌患者預(yù)后的獨立危險因子(HR=5.870，P=0.020)。

綜上所述，Survivin蛋白高表達(dá)和Caspase-3蛋白低表達(dá)對膽管癌的發(fā)生、發(fā)展可能存在協(xié)同作用。

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