張永峰，王永芹

(濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濰坊 261031)

肺炎支原體(MP)是小兒呼吸道感染的常見病原體之一，并有逐年上升趨勢(shì)。2007年3月～2009年3月，我們采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)法對(duì)320例肺炎患兒集咽拭子、血等標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，探討熒光定量PCR對(duì)兒童肺炎支原體感染的早期診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 肺炎患兒320例，男174例，女146例;年齡3個(gè)月～14歲，平均4.8歲。間接免疫熒光法檢測(cè)咽拭子呼吸道合胞病毒、腺病毒、EB病毒、流感病毒等常規(guī)病毒抗體均為陰性，依據(jù)第7版《實(shí)用兒科學(xué)》的標(biāo)準(zhǔn)。雙份血清抗體4倍以上升高或單次血清抗體滴度≥1∶160作為肺炎支原體感染診斷標(biāo)準(zhǔn)。急性期238例，其中輕癥(肺部體征輕，胸部X線表現(xiàn)為支氣管肺炎改變或間質(zhì)性肺炎改變或大葉性肺炎單葉受累)187例，重癥(肺部體征明顯，有實(shí)變體征，胸部X線表現(xiàn)為大葉性肺炎改變，兩個(gè)肺葉受累或有胸水和或有肺外并發(fā)癥)51例;恢復(fù)期82例。

1.2 檢測(cè)方法 患兒入院后24 h內(nèi)和恢復(fù)期行標(biāo)本采集，用無菌生理鹽水棉拭子直接擦拭咽后壁，浸于1 ml無菌生理鹽水中震蕩，密封冰盒運(yùn)送，－20℃保存，采用實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增儀(FTC-2000A)測(cè)定MP-DNA，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作;病程第5～7天及相隔1～2周采集靜脈血，采用微量顆粒凝集法測(cè)定MP抗體;熒光定量PCR法測(cè)定血MP-DNA，結(jié)果判定:閾值之上出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，Ct值＜38為陽(yáng)性，由儀器自動(dòng)算出DNA含量(基因拷貝數(shù)/ml);Ct值＞40為陰性，38～40為灰區(qū)，建議復(fù)查。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

320例患兒中微量顆粒凝集法陽(yáng)性116例，陽(yáng)性率為36.3%;熒光定量PCR法陽(yáng)性有108例，陽(yáng)性率為33.8%;兩種方法均陽(yáng)性96例，均陰性192例，符合率為91.8%。兩種檢測(cè)方法無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。320例患兒中，微量顆粒凝集法首次血清抗體＜1∶160的有204例，采集二次血清檢測(cè)抗體，雙份抗體呈4倍增高者35例，熒光定量PCR法32例為陽(yáng)性。雙份抗體增高不足4倍者169例，其中熒光定量PCR法亦為陰性者154例，二者符合率為90.12%。咽拭子和血標(biāo)本中MP-DNA陽(yáng)性率分別為33.8%、18.8%，MP-DNA 拷貝量分別為(3.70 ±0.44) ×102、(4.36 ± 0.53) × 103copy/ml，兩者比較P均＜0.01。重癥患兒血液及咽拭子MP-DNA的拷貝數(shù)分別為(8.53±2.27) ×102、(3.25±1.61) ×103copy/ml，輕癥患兒分別為(3.31 ±1.51)×102、(2.92 ±1.76) × 103copy/ml，兩者比較 P 均＜0.01。MP感染患兒急性期血液、咽拭子MP-DNA的拷貝數(shù)分別為(4.61±2.85) ×102、(4.08±2.65) ×103copy/ml，治療 2 周后分別為(1.30 ±1.43) ×102、(0.95 ± 0.73) × 103copy/ml，P 均 ＜0.01。

3 討論

肺炎支原體肺炎臨床表現(xiàn)多不典型，早期不易作出診斷。血清學(xué)MP-IgM檢查有一定的靈敏性、特異性，但特異性抗體高峰出現(xiàn)較晚，也有可能檢出持久存在的MP-IgM抗體;另外，重癥感染者可能不出現(xiàn)MP-IgM抗體，免疫功能低下的患者容易感染MP，感染后由于抗體產(chǎn)生不足、血清抗體不升高等原因，會(huì)造成免疫學(xué)檢測(cè)無效，特別是嬰幼兒，因而MP-IgM抗體檢測(cè)不宜作為惟一的診斷方法。FQPCR具有PCR技術(shù)的DNA高效擴(kuò)增、探針技術(shù)高特異性和光譜技術(shù)的敏感性及定量分析優(yōu)點(diǎn)，在數(shù)小時(shí)內(nèi)可以及時(shí)地提供結(jié)果，完全密封式操作可明顯降低污染造成的假陽(yáng)性，定量結(jié)果能夠客觀、適時(shí)地反映病情，故可作為肺炎支原體感染的早期診斷的有效方法［1］。

正常咽部極少有MP存在，故咽拭子MP檢測(cè)陽(yáng)性可為確診提供保證［2］。另外幼兒咽部取樣方便，年長(zhǎng)兒童亦可取痰等呼吸道標(biāo)本檢查。本研究發(fā)現(xiàn)，熒光定量PCR法與微量顆粒凝集法在檢測(cè)MP上無顯著性差異;204例首次抗體＜1∶160的患兒中，35例患兒經(jīng)微量顆粒凝集法對(duì)比雙份血清后才能診斷，而采用熒光定量PCR法入院時(shí)32例即能診斷，提示熒光定量PCR法與微量顆粒凝集法相比具有早期診斷的特點(diǎn)。

支原體可引起支原體血癥，直接侵犯各系統(tǒng)、組織引起病變［3］。國(guó)外報(bào)道從肺炎支原體呼吸道感染的病例血液中直接分離出肺炎支原體，提示肺炎支原體可進(jìn)入血流，有在呼吸系統(tǒng)以外的部位增殖的可能性［4］。血PCR檢查發(fā)現(xiàn)MP可以侵入血液，為MP肺外直接侵犯提供了依據(jù)，推測(cè)MP感染均有不同程度的血液侵入發(fā)生，若達(dá)一定程度，則能被靈敏的PCR技術(shù)檢測(cè)出來。本研究血液標(biāo)本PCR陽(yáng)性率低于咽拭子標(biāo)本，且MP-DNA平均拷貝值亦明顯低于咽拭子，提示僅部分肺炎支原體侵入血液中，引起支原體血癥。若依據(jù)血中MP的PCR檢查為是否MP感染的依據(jù)，有可能造成對(duì)MP感染的漏診，故不宜取血標(biāo)本檢查。本研究發(fā)現(xiàn)重癥患者血液MP-DNA的拷貝數(shù)明顯高于輕癥者，急性期咽拭子和血液MP-DNA的拷貝數(shù)亦明顯高于恢復(fù)期，證實(shí)MP-DNA的結(jié)果可用于判斷病情、評(píng)估療效、指導(dǎo)治療。

綜上所述，在MP感染急性期采用PCR法行咽拭子和血MP檢測(cè)，能明顯提高M(jìn)P感染的陽(yáng)性檢出率;早期正確診斷和合理治療可縮短住院時(shí)間和病程，減少并發(fā)癥，降低治療費(fèi)用，而且，若結(jié)合血熒光定量PCR法MP-DNA的檢測(cè)，對(duì)肺炎支原體肺炎病情判定及治療效果評(píng)估具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

［1］孫紅妹.肺炎支原體感染實(shí)驗(yàn)室診斷［J］.實(shí)用兒科臨床雜志，2007，22(4):245-247.

［2］侯安存，劉玉華，辛德莉，等.健康兒童鼻咽部常見致病微生物攜帶狀況及臨床意義［J］.中華兒科雜志，2002，40(1):45-49.

［3］鐘天鷹.熒光定量PCR法檢測(cè)呼吸系統(tǒng)感染兒童肺炎支原體DNA 的分析［J］.臨床兒科雜志，2002，20(3):137-139.

［4］Daxboeck F.Detection of Mycoplasma pneumoniae in serum specimens from patients with mycoplasma pneumoniae by PCR［J］.Int J Med Microbiol，2005，295(4):279-285.