劉春燕,馬秀敏,丁劍冰,諶宏鳴

(新疆醫(yī)科大學(xué)高職學(xué)院,烏魯木齊 830006)

包蟲(chóng)病是棘球絳蟲(chóng)的幼蟲(chóng)寄生于人及某些動(dòng)物等宿主體內(nèi)所致的一種嚴(yán)重的人畜共患性疾病。在不同的宿主中,棘球絳蟲(chóng)存在著實(shí)質(zhì)性的基因遺傳差異,為此采用基因診斷方法具有重要的診斷價(jià)值[1]。本研究采用PCR-RFLP和微衛(wèi)星DNA標(biāo)記法對(duì)包蟲(chóng)病棘球絳蟲(chóng)分離株的基因型進(jìn)行鑒定,希望為棘球絳蟲(chóng)的實(shí)驗(yàn)室診斷尋找一種快速有效分子生物學(xué)檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 40個(gè)包囊標(biāo)本來(lái)自 40例包蟲(chóng)病患者(男 22例、女 18例,年齡 18～65歲,漢族 32例、蒙古族5例、回族2例、維吾爾族1例)。無(wú)菌取囊組織,用生理鹽水漂洗后加入 95%的乙醇保存,以 1個(gè)包囊為 1個(gè)分離株。

1.2 引物合成 PCR-RFLP方法：在Genebank中查詢棘球絳蟲(chóng)線粒體DNA基因序列,根據(jù)其他研究報(bào)道的基因序列,用DNAman軟件輔助設(shè)計(jì)上、下游引物。rrnl上游引物為5′-GGTTTATTTGCCCCGCATCATGC-3′,下游引物為5′-ATCACGTCAAACCATTCAAACAAGC-3′,擴(kuò)增長(zhǎng)度為561 bp。微衛(wèi)星DNA標(biāo)記法：參照文獻(xiàn)和檢索Genebank中棘球絳蟲(chóng)微衛(wèi)星位點(diǎn),設(shè)計(jì)棘球絳蟲(chóng)微衛(wèi)星位點(diǎn)基因引物,正向引物5′端分別標(biāo)記不同顯色的熒光。Sea上游引物為5′-CGAAAGTGATGACAAACCAA-3′,下游引物為5′-CGTTGATGGAGATGAGGTCG-3′,擴(kuò)增長(zhǎng)度為561 bp。兩組引物由日本Genosys公司合成并標(biāo)記。

1.3 DNA的提取 取包蟲(chóng)病患者的包囊組織約25 mg,置培養(yǎng)皿中,漂洗 2遍后放入離心管中,嚴(yán)格按DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,提取基因組DNA。

1.4 PCR擴(kuò)增 PCR-RFLP方法：以棘球絳蟲(chóng)DNA為模板,加入引物,按常規(guī)方法擴(kuò)增基因片段。擴(kuò)增參數(shù)：94℃預(yù)變性2 min,94℃變性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸1min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸2 min。每次反應(yīng)均設(shè)立不含DNA模板的陰性對(duì)照和已知棘球絳蟲(chóng)DNA的陽(yáng)性對(duì)照。微衛(wèi)星DNA標(biāo)記法：以提取的棘球絳蟲(chóng)DNA為模板,加入熒光引物,按常規(guī)方法擴(kuò)增棘球絳蟲(chóng)三位點(diǎn)微衛(wèi)星序列。擴(kuò)增參數(shù)：94℃、1mim,94℃、30 s,55℃、30 s,72℃、30 s, 35個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。每次反應(yīng)均設(shè)立不含DNA模板的陰性對(duì)照和已知棘球絳蟲(chóng)DNA模板的陽(yáng)性對(duì)照。

1.5 數(shù)據(jù)分析 采用GeneSean5.1軟件進(jìn)行電泳圖象掃描和收集分析DNA片段,結(jié)合Genotype軟件分析收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行基因分型。

2 結(jié)果

以棘球絳蟲(chóng)DNA為模板,用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,可得到大小約為561 bp的擴(kuò)增條帶,產(chǎn)物的長(zhǎng)度與引物設(shè)計(jì)的預(yù)期產(chǎn)物長(zhǎng)度一致,且條帶清晰。以棘球絳蟲(chóng)DNA為模板,用Sea引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,可得到約90 bp的擴(kuò)增條帶,產(chǎn)物的長(zhǎng)度與引物設(shè)計(jì)的預(yù)期產(chǎn)物長(zhǎng)度一致,且條帶清晰,說(shuō)明PCR產(chǎn)物可信,可用來(lái)進(jìn)行基因掃描。40個(gè)分離株標(biāo)本經(jīng)熒光PCR及微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定均為細(xì)粒棘球絳蟲(chóng),其中 39個(gè)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)分離株標(biāo)本為細(xì)粒棘球絳蟲(chóng) G1基因型,1個(gè)分離株標(biāo)本為細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)G6基因型。熒光 PCR及微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定結(jié)果與DNA序列分析基因型結(jié)果完全一致。

3 討論

棘球絳蟲(chóng)屬于扁形動(dòng)物門(mén)的絳蟲(chóng)綱,其成蟲(chóng)寄生于犬科肉食動(dòng)物小腸內(nèi),呈扁平帶狀小型寄生蟲(chóng),幼蟲(chóng)寄生于人或其他動(dòng)物的肝、肺等器官中引起囊型包蟲(chóng)病[2]。棘球絳蟲(chóng)呈世界性分布,由于其由大量?jī)?nèi)部變異的蟲(chóng)株組成,在不同的地理環(huán)境和宿主中,棘球絳蟲(chóng)的蟲(chóng)株不同,對(duì)人群的傳播動(dòng)力學(xué)、致病性、抗原反應(yīng)、化療反應(yīng)等不同。因此,對(duì)棘球絳蟲(chóng)蟲(chóng)株的鑒定及種內(nèi)變異性的研究,可指導(dǎo)包蟲(chóng)病的診斷、抗包蟲(chóng)病藥物的選擇、疫苗的研制等[3]。已發(fā)現(xiàn)棘球絳蟲(chóng)感染與犬腸內(nèi)局部升高的免疫力之間有關(guān)聯(lián),有研究通過(guò)對(duì)新疆家犬小腸內(nèi)棘球絳蟲(chóng)的大體觀察及DNA檢測(cè),發(fā)現(xiàn)家犬存在棘球絳蟲(chóng)和多房棘球絳蟲(chóng)混合感染[4]。

微衛(wèi)星DNA是新近發(fā)現(xiàn)的一種DNA遺傳學(xué)標(biāo)志,具有易于篩選、種類繁多、分布廣泛、高度多態(tài)性、重組率低和在種群中表現(xiàn)出高度的個(gè)體特異性等特點(diǎn)。熒光PCR結(jié)合基因掃描基因分型法更加快速準(zhǔn)確,實(shí)現(xiàn)了全部操作自動(dòng)化,方法簡(jiǎn)單易行,需要的擴(kuò)增產(chǎn)物量少、靈敏度高、重復(fù)性好、信息量大,適用于大規(guī)模群體遺傳學(xué)研究及流行病學(xué)調(diào)查[5]。本研究以棘球絳蟲(chóng)的Sca微衛(wèi)星序列為分型標(biāo)記,利用熒光PCR基因掃描技術(shù)鑒定包蟲(chóng)病患者棘球絳蟲(chóng)分離株的基因型和雜合度,多個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)志聯(lián)合分析可提高基因分型的鑒別力。純合子的PCR產(chǎn)物由相同堿基序列的DNA片段組成,而雜合子的PCR產(chǎn)物則包括兩種不同長(zhǎng)度的DNA片段,長(zhǎng)度差異由核心序列的不同串聯(lián)重復(fù)數(shù)引起,通過(guò)精確測(cè)定PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度就能確定微衛(wèi)星基因型[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,39個(gè)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)分離株標(biāo)本為細(xì)粒棘球絳蟲(chóng) G1基因型,1個(gè)分離株標(biāo)本為細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)G6基因型,微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定結(jié)果與DNA基因型序列分析結(jié)果一致。在本研究中未發(fā)現(xiàn)棘球絳蟲(chóng)的雜和現(xiàn)象,可能是棘球絳蟲(chóng)大多為自體受精,發(fā)生雜合現(xiàn)象的機(jī)會(huì)較少所致。

隨著寄生蟲(chóng)分子遺傳學(xué)的發(fā)展,現(xiàn)已從研究細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的表型發(fā)展到研究其基因型。PCRRFLP以其簡(jiǎn)單、敏感、可靠、價(jià)廉、所需樣品量少、無(wú)需同位素等優(yōu)點(diǎn)為研究者們所接受[7]。本研究采用PCR-RFLP擴(kuò)增棘球絳蟲(chóng)rrnl基因序列,該序列長(zhǎng)度為561 bp。PCR-RFLP對(duì)棘球絳蟲(chóng)的基因型鑒別與DNA序列分析鑒別結(jié)果符合率達(dá)100%。

總之,PCR-RFLP方法和微衛(wèi)星DNA標(biāo)記法是簡(jiǎn)單、快速、有效的棘球絳蟲(chóng)基因型檢測(cè)診斷方法。但其在寄生蟲(chóng)學(xué)方面的應(yīng)用目前還處于初始階段。

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