李鉆芳 陳文列 陳榮

激光掃描共聚焦顯微術(shù)(laser scanning confocal microscopy，LSCM)是先進(jìn)的細(xì)胞和分子生物研究技術(shù)，是在熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上配置激光光源，掃描裝置，共聚焦裝置和檢測(cè)系統(tǒng)加以數(shù)據(jù)化的圖像處理技術(shù)而形成的新型顯微鏡技術(shù)，因其獨(dú)特的激光掃描裝置，具有不損傷細(xì)胞、共焦成像分辨率高、能層析掃描、實(shí)現(xiàn)多重?zé)晒夤捕ㄎ灰约澳苡^察樣品的三維圖像等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于形態(tài)學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)和環(huán)境科學(xué)以及抗腫瘤藥物研究等領(lǐng)域。

1 LSCM在腫瘤細(xì)胞凋亡檢測(cè)中的優(yōu)勢(shì)

促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡是許多中藥殺傷腫瘤細(xì)胞的重要途徑，中藥誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡成為中醫(yī)藥抗腫瘤機(jī)制的研究熱點(diǎn)之一。細(xì)胞凋亡時(shí)伴隨染色質(zhì)的降解及凋亡相關(guān)信號(hào)的傳遞，中藥可對(duì)細(xì)胞凋亡過(guò)程的不同環(huán)節(jié)進(jìn)行調(diào)節(jié)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，維持機(jī)體內(nèi)平衡，延緩或阻止組織病理過(guò)程的惡化。

細(xì)胞凋亡的常用檢測(cè)有形態(tài)學(xué)的光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，生物化學(xué)的DNA凝膠電泳法，流式細(xì)胞術(shù)等方法，但各自都有一定的局限性，如電鏡觀察制樣程序費(fèi)時(shí)、不易定量，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的是群體細(xì)胞或某一類細(xì)胞的各凋亡指標(biāo)，無(wú)法對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行定位分析，無(wú)法確定凋亡位點(diǎn)。而激光掃描共聚焦顯微術(shù)，通過(guò)結(jié)合各種特異性熒光探針，不僅能實(shí)現(xiàn)核酸、蛋白質(zhì)、抗體、受體等大分子的定位、定性、定時(shí)及定量檢測(cè)，還能從分子水平檢測(cè)到單細(xì)胞在活性狀態(tài)下的各指標(biāo)信號(hào)，在觀察細(xì)胞形態(tài)、檢測(cè)凋亡進(jìn)程及測(cè)定活細(xì)胞凋亡過(guò)程中鈣離子、線粒體膜電位、活性氧自由基變化等方面得到廣泛應(yīng)用。

2 LSCM在中藥與天然藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡研究中的應(yīng)用

2.1 觀察細(xì)胞核變化與凋亡小體

經(jīng)特異性的DNA、RNA熒光探針(如吖啶橙AO、碘化丙啶PI)或DNA熒光探針(如Hoechst33258、Hoechst33342、DAPI)等標(biāo)記后的細(xì)胞，用LSCM能獲得其細(xì)胞核清晰的圖像，能直觀地顯示細(xì)胞受損后DNA和RNA的變化，在凋亡細(xì)胞的LSCM圖像上可見(jiàn)細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮、DNA凝結(jié)而成的凋亡小體等；而AO或PI還可顯出細(xì)胞輪廓、凋亡細(xì)胞出芽等。不同于電鏡下觀察，LSCM能夠在保持細(xì)胞活性及完整性的前提下，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察和測(cè)量，其圖像質(zhì)量好、分辨率高，可以實(shí)現(xiàn)多重?zé)晒庑盘?hào)共同觀察，甚至可以獲得細(xì)胞三維重建圖像。此外，通過(guò)結(jié)合顯示凋亡早期細(xì)胞膜變化的靈敏指標(biāo)Annexin V，可準(zhǔn)確定位與定量觀察細(xì)胞膜與細(xì)胞核的凋亡位點(diǎn)。

王學(xué)習(xí)[1]、季宇彬[2,3]、高世勇[4]、周炳剛[5]等分別應(yīng)用LSCM結(jié)合AO熒光探針單標(biāo)法或AO/EB雙染法，研究扶正抑瘤顆粒含藥血清、龍葵堿、甘草黃酮、苦參堿對(duì)荷瘤小鼠H22肝癌細(xì)胞及S180腫瘤細(xì)胞或肝癌細(xì)胞HepG2、人乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞的DNA 、RNA含量或細(xì)胞核的變化，以及三維DNA熒光強(qiáng)度分布[5]，結(jié)果表明這些中藥、天然藥及其提取物可破壞腫瘤細(xì)胞核酸，降低DNA/RNA比值，抑制核酸復(fù)制與合成而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，甚至出現(xiàn)凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征。

韓健等[6]、焦鵬等[7]用LSCM結(jié)合Annexin V/FITC或Annexin V/PI雙染法，觀察臨床抗癌中藥冬凌草甲素、白花丹參根制劑對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823的抑制增殖或誘導(dǎo)凋亡的作用。楊洋等[8]觀察PI熒光標(biāo)記細(xì)胞核變化，研究槲皮素聯(lián)合順鉑對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖及凋亡影響，結(jié)果見(jiàn)細(xì)胞核收縮、凝集、碎裂等凋亡現(xiàn)象。周欣陽(yáng)等[9]應(yīng)用FITC熒光素標(biāo)記天花粉蛋白(TCS)，在LSCM下直接觀察TCS進(jìn)入黑色素瘤B16細(xì)胞動(dòng)態(tài)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)TCS能抑制黑色素瘤細(xì)胞活性、抑制分裂增殖，且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，出現(xiàn)凋亡小體。

柯文娟等[10]利用LSCM結(jié)合Hoechst33258染色，研究甘草次酸對(duì)髓系白血病細(xì)胞系K562 的抗癌機(jī)制，觀察到甘草次酸能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、產(chǎn)生凋亡小體而抑制其增殖。張春陽(yáng)等[11]、周欣陽(yáng)[9]應(yīng)用LSCM包括雙光子激發(fā)激光掃描顯微術(shù)結(jié)合Hoechst33258染色，觀察到TCS作用人絨癌細(xì)胞(JAR)、H22肝癌細(xì)胞后，核染色質(zhì)濃縮，出現(xiàn)凋亡小體等。

2.2 觀測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度

細(xì)胞質(zhì)中游離的Ca2+作為第二信使在凋亡信號(hào)傳遞過(guò)程中起關(guān)鍵作用，細(xì)胞核內(nèi)Ca2+濃度的持續(xù)升高是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的主要原因。在LCSM出現(xiàn)之前，對(duì)Ca2+的研究大都是通過(guò)死細(xì)胞進(jìn)行的，無(wú)法對(duì)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+信號(hào)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀測(cè)，而Ca2+的動(dòng)態(tài)變化是反映細(xì)胞生理過(guò)程及生理變化的重要信息。結(jié)合特異性Ca2+熒光探針Fluo-3/AM、Rhod-1、Indo-1、Fura-2等，LSCM不僅能夠精確測(cè)定其濃度，還可以在亞細(xì)胞水平上對(duì)細(xì)胞內(nèi)外Ca2+的活動(dòng)進(jìn)行精確的時(shí)間和空間上分布，提供其動(dòng)態(tài)變化的圖像，實(shí)時(shí)觀測(cè)藥物作用下細(xì)胞內(nèi)外Ca2+濃度的變化，從而判斷藥物的抗癌活性、治療效果等。

季宇彬等[12]、鄒翔等[13]、朱麗麗等[14]、孫紀(jì)元等[15]、高世勇等[4]、張長(zhǎng)城等[16]應(yīng)用LSCM結(jié)合Fluo-3/AM探針?lè)謩e觀察中西藥復(fù)方抗癌制劑海嘧啶、西蘭花中的抗癌活性成分葡萄糖異硫氰酸鹽GS、重樓皂苷、苦馬豆素、龍葵堿、青蒿琥酯等對(duì)人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞、人前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖的抑制作用，及經(jīng)各中藥、天然藥處理的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的動(dòng)態(tài)變化，表明上述中藥、天然藥均能升高Ca2+濃度，影響細(xì)胞周期，其凋亡作用機(jī)制與細(xì)胞內(nèi)鈣超載有關(guān)，而海嘧啶則可通過(guò)開(kāi)放細(xì)胞膜鈣通道和引起細(xì)胞內(nèi)鈣釋放兩條途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

2.3 觀測(cè)線粒體膜電位變化

細(xì)胞線粒體膜電位(MMP)是細(xì)胞能量產(chǎn)生的先決條件，其變化是細(xì)胞凋亡的一個(gè)早期特征，是細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)的標(biāo)志。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，細(xì)胞膜雙分子層中的磷脂不平衡分布會(huì)被破壞，發(fā)生磷脂外酰絲氨酸由內(nèi)層向外層的翻轉(zhuǎn)，暴露在外面的磷脂酰絲氨酸可以被周圍的吞噬細(xì)胞識(shí)別、吞噬，從而使凋亡的細(xì)胞得以被清除[17]。在各種藥物刺激下，通過(guò)LSCM測(cè)量線粒體特異性探針JC-1、Rhodamine123、Annexin V、TMRE等的熒光強(qiáng)度變化，就能反應(yīng)MMP的變化及線粒體功能狀態(tài)，不僅可以定量分析，還可對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)掃描，獲得藥物刺激下MMP瞬時(shí)動(dòng)態(tài)變化，及時(shí)反應(yīng)藥物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。

代志軍等[18]、王學(xué)習(xí)等[19]、高世勇等[4]用LSCM結(jié)合Rhodamine123或TMRE熒光探針研究中藥半枝蓮提取物(ESB) 含藥血清、糙葉敗醬提取物、龍葵堿分別作用于肝癌HepG2 、H22細(xì)胞及S180細(xì)胞后MMP的變化，結(jié)果均顯示各中藥或天然藥均可不同程度降低MMP，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

2.4 觀測(cè)活性氧自由基含量

活性氧自由基(ROS)是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和影響細(xì)胞衰老的主要因素之一，正常情況下，它的產(chǎn)生和消除處于平衡狀態(tài)，過(guò)量的ROS 會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子損傷，引起蛋白質(zhì)氧化，DNA鏈斷裂，細(xì)胞膜起泡、脂質(zhì)氧化等細(xì)胞凋亡特征，從而引發(fā)炎癥、癌癥等疾病。結(jié)合特異性熒光探針如DCFH-DA，利用熒光強(qiáng)度與活性氧濃度的線性關(guān)系，通過(guò)LSCM就能靈敏高效地檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)ROS含量的變化。

王學(xué)習(xí)等[1,19]利用LSCM結(jié)合D-399探針觀察扶正抑瘤顆粒含藥血清、糙葉敗醬提取物作用于S180細(xì)胞后ROS的變化，結(jié)果顯示提取物持續(xù)作用細(xì)胞48小時(shí)后，高劑量組細(xì)胞ROS增加，可能使DNA鏈斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

2.5 觀測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)

細(xì)胞凋亡的調(diào)控涉及許多基因，包括一些與細(xì)胞增殖有關(guān)的原癌基因和抑癌基因。其中研究較多的有Bcl-2基因家族、Caspase家族等。采用LSCM結(jié)合熒光抗體技術(shù)觀察相關(guān)基因表達(dá)，不僅可定位細(xì)胞內(nèi)各相關(guān)基因表達(dá)位點(diǎn)，還可同時(shí)定量每個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，間接反映目標(biāo)蛋白含量，以檢測(cè)藥物對(duì)各基因表達(dá)的影響。

季宇彬等[20,21]采用LSCM結(jié)合FITC染色，進(jìn)行肝癌HepG2細(xì)胞內(nèi)Caspase-3及Bcl-2的定位，并顯示龍葵堿能顯著升高細(xì)胞內(nèi)Caspase-3含量，降低Bcl-2含量，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

鄧剛等[22]用LSCM結(jié)合免疫熒光細(xì)胞化學(xué)，研究姜黃素對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞Notch1蛋白表達(dá)和亞細(xì)胞定位，顯示Notch1定位于胞膜、胞質(zhì)，且胞核表達(dá)增加，呈濃度依賴性，表明姜黃素誘導(dǎo)凋亡可能與Notch1 表達(dá)和核易位激活有關(guān)。

李祺福等[23,24]用LSCM結(jié)合免疫熒光抗體，分別觀察到人參皂甙Rg1、肉桂酸、丹參酮組合(RCT)誘導(dǎo)人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞分化過(guò)程中，Nucleophosmin(NPM)及prohibitin在MG-63細(xì)胞中，與c-fos、c-myc、RB、p53等基因產(chǎn)物具有共定位關(guān)系，并在RCT處理后細(xì)胞核內(nèi)其共定位區(qū)域發(fā)生了變化。

2.6 觀測(cè)細(xì)胞通訊

某些細(xì)胞癌變時(shí)，縫隙連接會(huì)減少甚至消失，喪失細(xì)胞間通訊能力，阻礙細(xì)胞間傳遞控制正常生長(zhǎng)的有關(guān)信息，這提示腫瘤細(xì)胞的快速分裂、增殖和轉(zhuǎn)移, 與縫隙連接的消失有關(guān)。通過(guò)測(cè)量細(xì)胞縫隙連接分子的轉(zhuǎn)移，可以研究腫瘤啟動(dòng)因子和生長(zhǎng)因子對(duì)縫隙連接介導(dǎo)的胞間通訊的抑制作用。LSCM可采用熒光光漂白恢復(fù)(FRAP)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞縫隙連接，通過(guò)觀察已發(fā)生熒光漂白細(xì)胞其熒光恢復(fù)過(guò)程的變化量，來(lái)判斷細(xì)胞縫隙連接的通訊功能。

王學(xué)習(xí)等[25]應(yīng)用LSCM結(jié)合CFDA-AM熒光探針，按FRAP分析程序，測(cè)定荷瘤小鼠H22細(xì)胞間通訊狀況，結(jié)果顯示不同劑量組扶正抑瘤顆粒含藥血清作用于H22細(xì)胞，細(xì)胞間熒光恢復(fù)速率即細(xì)胞間通訊狀況均有不同程度的提高。

2.7 其它

LSCM不僅能夠?qū)λ鶞y(cè)對(duì)象進(jìn)行實(shí)時(shí)顯微成像，還能檢測(cè)樣品的自發(fā)熒光光譜或新熒光探針的發(fā)射光譜，以及在標(biāo)記過(guò)程中造成的熒光探針光譜轉(zhuǎn)移等。利用此光譜掃描功能，可以進(jìn)一步確定抗腫瘤藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的分布情況及作用機(jī)制。

陳同生等[26,27]采用LSCM成像及熒光共振能量轉(zhuǎn)移( FRET)技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)及活細(xì)胞中SCAT3 質(zhì)粒的熒光光譜，分別研究中藥蟾酥、消癌平誘導(dǎo)人肺腺癌(ASTC-a-1)細(xì)胞凋亡過(guò)程中Caspase-3的活化特性，結(jié)果表明蟾酥能誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，出現(xiàn)凋亡小體，且Caspase-3參與調(diào)控蟾酥誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程，消癌平有效抑制細(xì)胞的增殖活性，并于作用72小時(shí)時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Caspase-3的活化。

3 展望

隨著激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)的普及，有關(guān)中藥抗腫瘤作用機(jī)制的研究日漸增多，檢測(cè)手段也日益先進(jìn)。在觀察細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞形態(tài)變化、測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、活性氧自由基、細(xì)胞膜電位等信號(hào)的變化以及DNA/RNA、基因蛋白表達(dá)、細(xì)胞周期等研究中，激光掃描共聚焦顯微技術(shù)顯示出很強(qiáng)的優(yōu)越性。它不僅可以動(dòng)態(tài)觀察藥物在細(xì)胞中的分布及其干預(yù)細(xì)胞的變化情況，還可以通過(guò)觀察不同時(shí)間段藥物與靶點(diǎn)的結(jié)合情況，了解其在細(xì)胞內(nèi)代謝過(guò)程，以判斷服藥的最佳時(shí)間，以進(jìn)一步提高藥效。

根據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)研究，抗腫瘤中藥主要有兩大類，一類是細(xì)胞毒藥物，一類是具有免疫增強(qiáng)作用、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑樣作用的藥物。中藥抗腫瘤具有多靶點(diǎn)、多效應(yīng)、不良反應(yīng)小、不易產(chǎn)生耐藥性、安全有效等優(yōu)點(diǎn)[28]。研究表明，中藥是通過(guò)多個(gè)環(huán)節(jié)起到抑制惡性腫瘤的作用[29]，目前LSCM技術(shù)在抗腫瘤藥物作用機(jī)制研究中，大部分僅局限于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡研究，對(duì)中藥活性物質(zhì)在體內(nèi)變化及作用特點(diǎn)、細(xì)胞毒作用、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、分子水平上抗腫瘤血管生成、抑制多藥耐藥、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移等機(jī)制研究中還比較少。中藥現(xiàn)代化過(guò)程中，隨著各學(xué)科間的發(fā)展和相互滲透，激光掃描共聚焦顯微技術(shù)有著廣闊的應(yīng)用前景，特別是在中藥抗腫瘤作用機(jī)理的基礎(chǔ)研究以及抗腫瘤新藥藥效研究上，將發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。

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