李曉霞，李延清，苗 苗，苗力孝

(延安大學(xué)a.化學(xué)與化工學(xué)院;b.生命科學(xué)學(xué)院，陜西延安716000)

0 前言

肝素鈉(Hep)為葡萄胺聚糖，是蛋白多糖的一種，由葡萄糖胺磺酸、葡萄糖磺酸、艾杜糖醛等通過(guò)糖苷鍵連接而成的重復(fù)二糖單元組成的線性鏈狀分子［1］。Hep是心血管和血栓病人的首選抗凝血藥，對(duì)不同的疾病，Hep有不同的最適劑量，臨床上需要進(jìn)行監(jiān)控。因此，研究Hep有一定的現(xiàn)實(shí)意義。目前Hep的檢測(cè)方法主要分為生物方法［2］和化學(xué)方法兩大類(lèi)。化學(xué)方法有分光光度法［3］、熒光法［4］、光散射法［5］、高效液相色譜法［6］、毛細(xì)管電泳法［7］等。這些方法或存在靈敏度低、操作繁瑣或儀器設(shè)備昂貴等缺點(diǎn)。電化學(xué)分析法具有靈敏度高、線性范圍寬、儀器價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，是一種簡(jiǎn)單、快速、有效的分析方法。由于Hep是一種生物多糖，其本身沒(méi)有電化學(xué)活性，因此，利用電化學(xué)分析方法研究Hep的相關(guān)研究報(bào)道相對(duì)較少［8－10］。

利用納米粒子聚合物復(fù)合膜修飾電極測(cè)定Hep的還未見(jiàn)報(bào)道。文獻(xiàn)［11］發(fā)現(xiàn)將亞甲基藍(lán)(MB)電聚合在CNTs側(cè)壁上，不僅能增加吸附強(qiáng)度，還能使電荷傳遞速率加快。因此，將MB通過(guò)電聚合的方法非共價(jià)固定在多壁碳納米管(MWNT)修飾電極表面，制備了聚亞甲基藍(lán)－碳納米管修飾玻碳電極(PMB-MWNT/GCE)。實(shí)驗(yàn)利用電極上的PMB與溶液中Hep通過(guò)靜電作用形成復(fù)合物，導(dǎo)致PMB的峰電流值降低，據(jù)此對(duì)Hep進(jìn)行分析測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

肝素鈉(Hep，150 IU/mg，上海國(guó)藥集團(tuán)生物化學(xué)試劑有限公司)。肝素鈉注射液(12 500 IU/2 mL，1 mg=160 IU，江蘇萬(wàn)邦制藥公司)。多壁碳納米管(MWNT，i.d 10～20 nm，純度＞95%，深圳市納米港有限責(zé)任公司)。亞甲基藍(lán)(MB)(上海試劑三廠)。肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 mg/mL):準(zhǔn)確稱(chēng)取0.100 g Hep，加水溶解后，定容于100 mL棕色容量瓶中，存儲(chǔ)于4℃ 冰箱內(nèi)，使用時(shí)用二次蒸餾水逐級(jí)稀釋。伯瑞坦－羅比森緩沖溶液 (B-R)以磷酸、乙酸、硼酸配制。實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

電化學(xué)測(cè)量使用BAS(Epsilon)電化學(xué)工作站(美國(guó))。超聲波清洗機(jī)KQ5200B(昆山市超聲儀器有限公司)。以玻碳電極(GCE，φ=2 mm)、碳納米管修飾玻碳電極(MWNT/GCE)、聚亞甲基藍(lán)修飾玻碳電極(PMB/GCE)或聚亞甲基藍(lán)/碳納米管修飾玻碳電極(PMB-MWNT/GCE)為工作電極，對(duì)電極為鉑絲電極，參比電極為飽和甘汞電極(SCE Sat.KCl)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 修飾電極的制備

GCE電極的預(yù)處理、MWNT的酸化處理及MWNT/GCE的制備參考文獻(xiàn)［12］。取5μL MWNT懸浮液滴涂在處理好的GCE表面，待溶劑揮發(fā)后即MWNT/GCE。將制備好的MWNT/GCE或GCE進(jìn)行電聚合［11］即獲得PMB-MWNT/GCE或PMB/GCE電極。用二次蒸餾水淋洗干凈，室溫下保存。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

電化學(xué)測(cè)量使用BAS(Epsilon)電化學(xué)工作站三電極系統(tǒng)。采用微分脈沖伏安法(DPV)對(duì)Hep進(jìn)行定量分析。DPV的條件:電位范圍－0.5～0.1 V，脈沖寬度50 ms，振幅50 mV，采樣寬度為200 ms，富集時(shí)間55 s。除非特別說(shuō)明，所有電化學(xué)實(shí)驗(yàn)均在pH 4.5的B-R緩沖溶液中，室溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以SCE參比電極電位為標(biāo)準(zhǔn)。其中空白溶液中PMB氧化電流信號(hào)為Ipo，加入Hep后PMB氧化電流信號(hào)為Ipi，計(jì)算PMB氧化峰電流差值△Ip=Ipo－Ipi。以△Ip與CHep作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 循環(huán)伏安法研究PMB與Hep相互作用

圖1為PMB-MWNT/GCE在pH 4.5的B-R緩沖液及與不同濃度的Hep作用后的CV圖。曲線1為PMB-MWNT/ GCE在B-R緩沖液中的CV圖，在pH 4.5的B-R緩沖液中，在－0.167 V和－0.218 V出現(xiàn)一對(duì)氧化還原峰，為PMB的氧化還原峰。曲線2、曲線3和曲線4為PMB-MWNT/GCE與不同濃度的Hep作用后的CV圖，可以看出在該掃描電位范圍內(nèi)，并沒(méi)有出現(xiàn)新的氧化還原峰。PMB的氧化還原峰電流明顯降低，氧化還原峰電位稍有變化。說(shuō)明PMB與Hep之間存在相互作用。它們結(jié)合形成的復(fù)合物不具有電化學(xué)活性，致使電極上自由的PMB濃度減小，最終導(dǎo)致了氧化還原峰電流的降低。原因是Hep在水溶液中由于其酸性基團(tuán)的離解而成為帶多個(gè)負(fù)電荷的大陰離子，而PMB是陽(yáng)離子染料，兩者可以通過(guò)靜電作用發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，導(dǎo)致了PMB峰電流降低，利用峰電流的降低可以建立電化學(xué)檢測(cè)Hep的分析新方法。

圖1 PMB-MWNT/GCE在不同濃度Hep溶液中的循環(huán)伏安圖

研究了不同掃描速度對(duì)PMB的電化學(xué)行為的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2a。從圖2b可以看出:PMB的氧化峰電流(Ipa)、還原峰電流(Ipc)與掃描速度(v)在10～500 mV/s之間存在良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r分別為0.998 7、0.999 1。表明PMB-MWNT/GCE電極上PMB的電化學(xué)氧化反應(yīng)過(guò)程是受吸附控制的電極反應(yīng)過(guò)程。圖2c研究了掃描速率與峰電位的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在低掃描速度時(shí)，電位不隨掃速的變化而變化;隨著掃速的繼續(xù)增加，氧化峰電位向正方向移動(dòng)，還原峰電位向負(fù)方向移動(dòng)。根據(jù)Laviron方程式

式中，α為電子轉(zhuǎn)移系數(shù)，其值可由高掃描速度下Ep～log v線性關(guān)系的斜率求得［13］。求出α后，代入式(1)可求出非均相電子轉(zhuǎn)移常數(shù)ks。從圖2c的內(nèi)圖可以看出:在高掃描速度范圍內(nèi)，△Ep與log v呈線性關(guān)系(△Ep=0.472 log v－0.819，r=0.993 3)，據(jù)此可以計(jì)算出α和ks分別為0.85和3.92 s－1。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

(1)底液的選擇:分別以NaAc-HAc溶液、HClO4、PBS溶液、B-R溶液為支持電解質(zhì)，進(jìn)行CV掃描。實(shí)驗(yàn)表明:PMB在B-R溶液中的峰形最好，穩(wěn)定且靈敏度高，因此，以B-R緩沖液為Hep測(cè)定的底液。

圖2 不同掃速下PMB的循環(huán)伏安圖;掃速與峰電流、峰電位的關(guān)系

(2)pH的選擇:實(shí)驗(yàn)中利用CV考察了在pH 2.5～8.5范圍內(nèi)的Hep-B-R緩沖液中PMB-MWNT/ GCE的電化學(xué)行為。結(jié)果發(fā)現(xiàn):PMB的氧化峰電位Epa隨著pH增大向正方向移動(dòng)、還原峰電位Epc隨著底液pH增大向負(fù)方向移動(dòng)。峰電位與pH呈良好的線性關(guān)系，線性方程分別為Epa(V)=－0.039 6pH +0.037 8，r=0.991 6，Epc(V)=－0.039 4pH－0.008 4，r=0.992 0。表明有質(zhì)子參與PMB的電化學(xué)氧化還原反應(yīng)。在pH 2.5～8.5范圍內(nèi)，峰電流差△Ip隨pH增大發(fā)生變化，pH=4.5時(shí)△Ip達(dá)到最大。因此，選擇pH 4.5進(jìn)行分析測(cè)定。

(3)MB聚合圈數(shù)的選擇:實(shí)驗(yàn)中考察了聚合圈數(shù)10～30時(shí)，對(duì)Hep測(cè)定的影響。當(dāng)聚合圈數(shù)從10圈開(kāi)始，隨著聚合圈數(shù)的增加，△Ip逐漸增大，聚合圈數(shù)為20圈時(shí)△Ip達(dá)到最大，20圈后隨著圈數(shù)的增加△Ip降低。可能是因?yàn)楫?dāng)聚合到一定程度后，膜會(huì)變得越來(lái)越致密，阻礙了電流的傳輸。因此，實(shí)驗(yàn)中選擇聚合圈數(shù)為20圈。

(4)富集時(shí)間的選擇:研究了富集時(shí)間對(duì)復(fù)合物電化學(xué)行為的影響。采用開(kāi)路富集，在30～150 s范圍內(nèi)考察富集時(shí)間對(duì)PMB氧化峰電流的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，富集時(shí)間為30～55 s時(shí)，峰電流差△Ip流隨著富集時(shí)間的增加而增大，大于55 s后峰電流開(kāi)始緩慢降低，因此，選擇富集時(shí)間為55 s。

2.3 線性范圍、精密度和檢出限

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，利用PMB-MWNT/GCE對(duì)Hep進(jìn)行測(cè)定。圖3為PMB-MWNT/GCE在不同濃度Hep的DPV曲線及其線性關(guān)系。PMB峰電流的降低值△Ip與Hep的濃度在0.33～17.13μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為△Ip(μA)=1.6c+11.2(μg/mL)，相關(guān)系數(shù)為0.994 6。檢出限為0.09μg/mL。用同一支修飾電極對(duì)5.74μg/mL的Hep進(jìn)行11次平行測(cè)定，RSD為0.40%，將電極平行修飾6次，對(duì)5.74μg/mL的Hep進(jìn)行7次平行測(cè)定，RSD為1.83%，表明制備的PMB-MWNT/GCE有良好的重復(fù)性和再現(xiàn)性。與文獻(xiàn)［8］報(bào)道結(jié)果相比(線性范圍為0.2～4.0μg/mL，檢出限為0.072 mg/L)，本法測(cè)定Hep的線性范圍更寬。而且本法使用修飾電極克服了使用滴汞電極造成的污染。

圖3 不同濃度的Hep中PMB的微分脈沖伏安曲線及其Hep的線性關(guān)系圖

2.4 共存物質(zhì)的影響

對(duì)常見(jiàn)的葡萄糖、淀粉、麥芽糖、蔗糖及表面活性劑(SDBS和CTAB)等共存物質(zhì)對(duì)該體系的干擾進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明:相同濃度的葡萄糖、淀粉、麥芽糖、蔗糖對(duì)Hep測(cè)定的影響不大，分別為3.61%、－3.31%、－4.86%和2.38%。而表面活性劑SDBS和CTAB對(duì)反應(yīng)有影響。離子型表面活性劑的加入會(huì)極大地干擾體系的測(cè)定，可能是由于Hep與PMB的結(jié)合主要是通過(guò)靜電引力的作用，陰陽(yáng)離子型表面活性劑加入后會(huì)在溶液中發(fā)生解離并同PMB發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，從而影響PMB與Hep的結(jié)合［8］。

2.5 樣品分析

精確移取Hep注射液1 mL(江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司，產(chǎn)品批號(hào):0706121，標(biāo)示效價(jià)12 500 IU/2 mL，1 mg=160 IU)于100 mL容量瓶中，用二次蒸餾水稀釋至刻度，搖勻;吸取上述稀釋液3 mL于10 mL比色管中，在優(yōu)化條件下按實(shí)驗(yàn)方法1.2進(jìn)行測(cè)定。對(duì)所分析樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)加入回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可以看出:回收率分別在97%～102%之間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:本方法可以成功用于Hep注射液的測(cè)定，結(jié)果令人滿(mǎn)意。

表1 肝素鈉注射液樣品測(cè)定的回收率實(shí)驗(yàn)

3 結(jié)論

本文以聚合的PMB為電化學(xué)探針，利用在酸性條件下PMB能與Hep發(fā)生相互作用而導(dǎo)致PMB電化學(xué)信號(hào)降低，建立了測(cè)定Hep的微分脈沖伏安分析新方法。本文建立的方法與其他電化學(xué)方法［8－10］比較，具有穩(wěn)定、響應(yīng)時(shí)間短、靈敏、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)。本方法有望用于其他生物多糖分子的分析測(cè)定。

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