徐冬冬 黃花張明陽

(川北醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系四川南充637000;①四川省南充精神衛(wèi)生中心;②南通大學(xué)法醫(yī)系)

腫瘤組織進(jìn)行法醫(yī)DNA分析的研究進(jìn)展

徐冬冬 黃花①張明陽②

(川北醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系四川南充637000;①四川省南充精神衛(wèi)生中心;②南通大學(xué)法醫(yī)系)

腫瘤法醫(yī)學(xué)DNA分析遺傳不穩(wěn)定性短串聯(lián)重復(fù)序列

腫瘤研究與法醫(yī)DNA分型之間的關(guān)系可能并不明確，因?yàn)楹Y選法醫(yī)分析用短患聯(lián)重復(fù)序列(STR)一條重要的標(biāo)準(zhǔn)就是不能與已知疾病遺傳標(biāo)記之間有關(guān)聯(lián)。然而，在一些特殊情況下腫瘤組織也可能用于法醫(yī)DNA分型，例如對(duì)失蹤人員或者災(zāi)難遇害者的個(gè)人識(shí)別，生前采集的活體組織可能是留下的唯一可用于DNA分析的樣本。更為常見的情況是貼錯(cuò)標(biāo)簽或者弄混樣本，通過DNA分型技術(shù)可將活檢樣本與患者之間匹配。類似的情況還有對(duì)被控父親已經(jīng)死亡的親權(quán)鑒定，如果被控父親已經(jīng)下葬或者火化，可以調(diào)取現(xiàn)存組織樣本進(jìn)行檢驗(yàn)。目前已知多種腫瘤存在遺傳不穩(wěn)定性，表現(xiàn)為癌細(xì)胞上的雜合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)或者微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability，MSI)。這種不穩(wěn)定性也出現(xiàn)于腫瘤組織的DNA重復(fù)序列，可能會(huì)影響到結(jié)構(gòu)與之類似的法醫(yī)DNA分型用STR遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，從而影響DNA分型結(jié)果。

1 腫瘤遺傳學(xué)

典型的腫瘤發(fā)生要依靠多個(gè)突變，這些突變存在個(gè)體差異且為單細(xì)胞的多個(gè)突變。腫瘤從發(fā)生到發(fā)展整個(gè)演變過程既與遺傳突變和環(huán)境因素有關(guān)，也與基因變異和調(diào)控基因產(chǎn)物缺失有關(guān)。這個(gè)過程與癌基因的激活、抑癌基因的失活和調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因改變有關(guān)?；蚩梢远喾N方式發(fā)生突變，包括缺失突變、點(diǎn)突變和染色體重排等方式均可導(dǎo)致癌基因的激活。抑癌基因可在表觀遺傳學(xué)改變等一些已知方式下失活，如啟動(dòng)子的甲基化。調(diào)控細(xì)胞生長和分化的原癌基因過度激活，突變后轉(zhuǎn)化為癌基因。例如編碼跨膜受體的c－erbB2(又叫Her2/ neu)原癌基因在多種人類腫瘤中出現(xiàn)過度表達(dá)，如乳腺癌、卵巢癌和胃癌等［1］。通過免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，c－erbB2原癌基因在卵巢癌有＜25%過度表達(dá)，乳腺癌20%～30%，子宮內(nèi)膜癌＜10%［2］。這種跨膜蛋白的過度表達(dá)與疾病的預(yù)示有潛在聯(lián)系。其它癌基因，例如與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白有關(guān)的ras基因，由于點(diǎn)突變導(dǎo)致大量表達(dá)可見于多種腫瘤［3］。

抑癌基因是指細(xì)胞內(nèi)具有限制原癌基因變異、抑制細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、維持細(xì)胞正常生長作用的基因。當(dāng)抑癌基因不表達(dá)或失活時(shí)，癌變細(xì)胞便能逃避機(jī)體免疫機(jī)制的控制，導(dǎo)致細(xì)胞的惡化及轉(zhuǎn)移。定位于染色體18q21的結(jié)直腸癌缺失基因(deleted in colorectal carcinoma，DCC)是一個(gè)重要的抑癌基因，與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、預(yù)后關(guān)系密切，在結(jié)直腸癌通常會(huì)表現(xiàn)出的LOH［4］。bcl－2基因的過度表達(dá)與細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)控有關(guān)聯(lián)，阻止了細(xì)胞凋亡［5］。由于腫瘤細(xì)胞的遺傳不穩(wěn)定性，基因組中的大量基因出現(xiàn)缺失或者功能性缺陷。在多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了抑癌基因的缺失和(或)失活，而LOH或MSI都可導(dǎo)致這種情況發(fā)生。

2 雜合性缺失

雜合性缺失即一個(gè)位點(diǎn)上兩個(gè)多態(tài)性的等位基因中的一個(gè)出現(xiàn)突變或缺失。LOH在腫瘤細(xì)胞中是一種非常常見的DNA變異，這種現(xiàn)象可經(jīng)多種途徑發(fā)生，包括基因缺失、基因轉(zhuǎn)換、有絲分裂重組和染色體丟失。腫瘤發(fā)生時(shí)，缺失區(qū)域可表現(xiàn)為抑癌基因功能缺失，由于另一條染色體上的抑癌基因功能仍可能正常，因此人體仍可以健康活著。但根據(jù)Knudson的二次打擊學(xué)說［6］，另一條染色體上的抑癌基因也會(huì)突變，從而失去對(duì)人體的保護(hù)。當(dāng)LOH在基因組包含大量多態(tài)性位點(diǎn)的區(qū)域中遍布存在時(shí)，即意味著發(fā)生了染色體區(qū)域缺失。目前用于檢測(cè)特定位點(diǎn)LOH的方法是對(duì)腫瘤細(xì)胞全基因組的掃描。最近興起的人類基因組測(cè)序和生物信息學(xué)工具的使用，可以幫助快速準(zhǔn)確的找到腫瘤相關(guān)基因。

3 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性

微衛(wèi)星是基因組中大量、隨機(jī)存在的簡單串聯(lián)重復(fù)序列［7］。人類最常見的微衛(wèi)星是CA二核苷酸重復(fù)，可在基因組中出現(xiàn)上萬次。由于在小衛(wèi)星中出現(xiàn)了等位基因重復(fù)次數(shù)的變異，因此大部分微衛(wèi)星具有高度多態(tài)性。然而，每個(gè)個(gè)體特定的微衛(wèi)星長度是固定的。MSI是指個(gè)體微衛(wèi)星中出現(xiàn)了基因條帶增多和大小的改變。MSI與DNA修復(fù)過程缺陷有關(guān)，通常是腫瘤發(fā)生的早期事件。與MSI有關(guān)的典型腫瘤是遺傳性非息肉性結(jié)腸直腸癌。通過對(duì)結(jié)腸直腸癌的研究，人們發(fā)現(xiàn)了形成MSI的兩種不同機(jī)制。第一種，錯(cuò)配修復(fù)基因產(chǎn)生遺傳變異，導(dǎo)致了微衛(wèi)星重復(fù)序列的復(fù)制錯(cuò)誤未得到修復(fù)，產(chǎn)生了可能會(huì)使抑癌基因失活的移碼突變;第二種，表觀遺傳學(xué)的改變?nèi)鏒NA甲基化可能會(huì)使重要的錯(cuò)配修復(fù)酶基因沉默。兩種當(dāng)中的任何機(jī)制，均可引起抑癌基因因缺失或者插入而失活，從而導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖最終產(chǎn)生腫瘤。MSI還可見于其他一些惡性腫瘤，包括乳腺癌、膀胱癌和肺癌。Applied Biosystems公司應(yīng)用法醫(yī)分析用STR SGM Plus試劑盒對(duì)人體多種類型腫瘤進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)多個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)了LOH和MSI。

4 法醫(yī)STR遺傳標(biāo)記

由于遺傳不穩(wěn)定性在腫瘤研究中的突出作用，一些研究人員開始在多種腫瘤組織中研究與法醫(yī)分析用STR遺傳標(biāo)記的突變率。與此同時(shí)，基于四核苷酸重復(fù)序列的微衛(wèi)星序列的法醫(yī)分型用STR遺傳標(biāo)記也在國內(nèi)外DNA分型中快速發(fā)展?；诖朔N原因，Hoff－Olsen等［8］將取自同一患者的血液樣本和結(jié)腸直腸腺癌樣本分別進(jìn)行法醫(yī)分析用四核苷酸遺傳標(biāo)記分型。通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織的DNA分型均出現(xiàn)了MSI，其中hum-FES/FPS在群體調(diào)查研究改變頻率最大，為17%。在肺癌、胰腺癌中也觀察到類似的情況。這說明遺傳不穩(wěn)定性確實(shí)影響到了法醫(yī)DNA分型用的四核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星。

由于表現(xiàn)出MSI和LOH的DNA分型結(jié)果很容易與自然操作誤差混淆，因此在對(duì)腫瘤組織的DNA分型結(jié)果解釋時(shí)應(yīng)格外謹(jǐn)慎。由于新的等位基因的出現(xiàn)，MSI可表現(xiàn)出與原始供體不同長度的等位基因。如果MSI導(dǎo)致了重復(fù)基序相對(duì)于原始等位基因出現(xiàn)較短距離移動(dòng)，這種情況很可能被DNA分析專家解釋為影子帶。影子帶是法醫(yī)DNA分型中最常見的現(xiàn)象，是由于PCR過程中出現(xiàn)了Taq聚合酶的滑動(dòng)，從而導(dǎo)致檢測(cè)到的產(chǎn)物與實(shí)際等位基因長度不同。影子帶是使用Taq聚合酶擴(kuò)增STR不可避免的現(xiàn)象［9］，當(dāng)所擴(kuò)增的在實(shí)際等位基因峰高＞4000 RFU(相對(duì)熒光的單位)的電泳圖譜尤為明顯。每個(gè)STR基因座甚至等位基因之間都有不同的影子帶特征，但是很少見到影子帶峰高超過相關(guān)等位基因峰高的15%。任何于影子帶位置發(fā)現(xiàn)的峰高＞15%相關(guān)等位基因峰高的通常認(rèn)為是混合DNA樣本［9］。腫瘤組織DNA分型電泳圖譜另一個(gè)特征是雜合子等位基因擴(kuò)增不平衡。DNA擴(kuò)增理想情況是雜合子的每個(gè)等位基因峰面積應(yīng)該是相當(dāng)?shù)模任换蛑g的擴(kuò)增效率差異導(dǎo)致了等位基因的不平衡擴(kuò)增。而甲醛固定石蠟包埋腫瘤組織，由于DNA含量很小同時(shí)出現(xiàn)了降解，不平衡擴(kuò)增現(xiàn)象尤為明顯。微量DNA的擴(kuò)增很容易出現(xiàn)DNA分型失敗或部分分型，這種情況很可能被錯(cuò)誤的解釋為LOH。

當(dāng)以口腔癌患者特別是在臺(tái)灣嚼檳榔者的口腔拭子作為對(duì)照樣本時(shí)，腫瘤患者醫(yī)學(xué)樣本用于法醫(yī)DNA分型時(shí)出現(xiàn)的另一個(gè)問題［10，11］。刑事警察也曾多次將嚼過的檳榔殘留物視為重要證據(jù)用于DNA分析。為了弄清口腔癌患者口腔拭子STRDNA分型的可能存在的問題，Pai CY等［12］將分別取自100名口腔癌患者，100名健康的嚼檳榔者和100名健康的不嚼檳榔者的口腔拭子和外周血樣本分別進(jìn)行AmpFlSTR Profiler(Applied Biosystems)9個(gè)STR位點(diǎn)試劑盒擴(kuò)增。結(jié)果表明作為參照的外周血樣本DNA分型與口腔拭子DNA分型在口腔癌患者中有33%的偏移。而兩個(gè)健康對(duì)照組的外周血樣本DNA分型與口腔拭子DNA分型均未表現(xiàn)出偏移，這表明是口腔癌而非嚼檳榔與檢測(cè)到的遺傳改變有關(guān)。在口腔癌患者中也檢測(cè)到了LOH和微衛(wèi)星不穩(wěn)定，其中5名患者同時(shí)出現(xiàn)了這兩種類型的遺傳不穩(wěn)定性。這些發(fā)現(xiàn)同樣被很多其它的文獻(xiàn)所證實(shí)［12］，因此當(dāng)口腔癌患者出現(xiàn)遺傳不穩(wěn)定性時(shí)不應(yīng)提取口腔試子用于法醫(yī)學(xué)鑒定。

盡管法醫(yī)分析用STR與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的基因之間并沒有明確的關(guān)聯(lián)，然而它們卻受到了腫瘤發(fā)生引起的遺傳學(xué)改變的影響。在多種類型腫瘤基因組中DNA重復(fù)區(qū)域均檢測(cè)到了LOH和或MSI，這些區(qū)域也包括法醫(yī)分析用STR的所有商業(yè)試劑盒。雖然已經(jīng)明確指出了在腫瘤組織中法醫(yī)分析用STR受到了LOH和MSI的影響，但是腫瘤組織用于法醫(yī)鑒定的情況還是很少見的。對(duì)于腫瘤患者，一旦有多種DNA來源，不應(yīng)選擇活檢組織。同樣，對(duì)已經(jīng)確診為口腔癌的個(gè)體采集DNA參照樣本時(shí)，也不應(yīng)選用口腔拭子。如果不存在備選樣本，研究者應(yīng)該充分考慮到遺傳不穩(wěn)定性對(duì)被分析位點(diǎn)的潛在影響，同時(shí)謹(jǐn)慎發(fā)表自己的發(fā)現(xiàn)。

［1］Hynes NE.Amplification and overexpression of the erbB－2 gene in human tumors：its involvement in tumor development，significance as a prognostic factor，and potential as a target for cancer therapy［J］.Semin Cancer Biol，1993，4：19

［2］Villella JA，Cohen S，Smith DH，et al.HER－2/neu overexpression in uterine papillary serous cancers and its possible therapeutic implications［J］.Int J Gynecol Cancer，2006，16：1897

［3］胡勇，向近敏，趙文先.ras癌基因研究進(jìn)展［J］.中國腫瘤臨床，1991，18(3)：187

［4］趙坡，胡穎川.結(jié)直腸腺癌DCC基因微衛(wèi)星丟失與預(yù)后［J］.中華病理學(xué)雜志，1996，25(4)：109

［5］陳揚(yáng)超，周克元.Bcl－x基因及其對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1999，26(6)：534

［6］Knudson A G.Hereditary cancer：two hits revisited［J］.Cancer Res Clin Oncol，1996，122(3)：135

［7］Hovig E，Smith－Sorensen B，Uitterlinden AG，et al.Detection of DNA variation in cancer［J］.Pharmacogenetics，1992，2：317

［8］Hoff－Olsen P，Meling GI，Olaisen B.Variation in mutation rate and direction between tetranucleotide STR loci in human colorectal carcinomas［J］.Ann Hum Genet，1998，62：1

［9］Gill P，Sparkes R，Kimpton C.Development of guidelines to designate alleles using an STR multiplex system［J］.Forensic Sci Int，1997，89：185

［10］Yang CH，Hsieh LL，Tsai CW，et al.Evaluation of the DNA stability of forensic markers used in betel－quid chewers＇oral swab samples and oral cancerous specimens：implications for forensic application［J］.J Forensic Sci，2003，48：88

［11］Pai CY，Hsieh LL，Tsai CW，et al.Allelic alterations at the STR markers in the buccal tissue cells of oral cancer patients and the oral epithelial cells of healthy betel quid－chewers：an evaluation of forensic applicability［J］.Forensic Sci Int，2002，129：158

［12］Zienolddiny S，Aguelon AM，Mironov N，et al.Genomic instability in oral squamous cell carcinoma：relationship to betel－quid chewing［J］.Oral Oncol，2004，40：298

(2010－10－11收稿)(肖永紅 編輯)

DF 795.1

A

1008－6633(2011)01－040－03