王 丹，李 彥，孫桂媛，汪 卓

（1.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，遼寧沈陽 110001；2.沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院藥理學(xué)實驗教學(xué)中心，遼寧沈陽 110016；3.何氏醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧沈陽 110163）

·論 著·

兔角膜上皮細(xì)胞體外原代培養(yǎng)和鑒定

王 丹1，3，李 彥2，孫桂媛1*，汪 卓3*

（1.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，遼寧沈陽 110001；2.沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院藥理學(xué)實驗教學(xué)中心，遼寧沈陽 110016；3.何氏醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧沈陽 110163）

目的建立體外原代培養(yǎng)兔角膜上皮細(xì)胞簡單經(jīng)濟(jì)實用的方法，并觀察其體外生長的生物學(xué)特性。方法采用全角膜組織培養(yǎng)法培養(yǎng)兔角膜上皮細(xì)胞并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，通過形態(tài)學(xué)觀察并應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果兔角膜上皮原代培養(yǎng)第2天，組織邊緣有細(xì)胞游出，細(xì)胞和細(xì)胞核均呈圓形，胞核位于細(xì)胞中央或旁中央?yún)^(qū)；第3天，細(xì)胞呈扁平多邊形，相互連接成片；兔角膜上皮原代培養(yǎng)第7天，局部可見懸浮細(xì)胞生長；兔角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)第2代第2天，細(xì)胞生長旺盛，部分細(xì)胞貼壁呈片狀多邊形。兔角膜細(xì)胞免疫組織化學(xué)顯示廣譜角蛋白單克隆抗體陽性。結(jié)論全角膜培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞簡單實用，可獲得狀態(tài)良好的連續(xù)傳代擴(kuò)增的細(xì)胞。

角膜；上皮細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；兔

角膜細(xì)胞成分培養(yǎng)是現(xiàn)代角膜病研究和治療的基礎(chǔ)，近年來，隨著研究深入，對角膜細(xì)胞成分培養(yǎng)提出了更高要求。以往的培養(yǎng)方法復(fù)雜，對細(xì)胞損傷較大，導(dǎo)致活力降低，為此我們改良了體外原代培養(yǎng)兔角膜上皮細(xì)胞的方法，以建立一種簡單、經(jīng)濟(jì)、實用的兔角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：健康新西蘭白兔6只，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～2.5kg。眼部經(jīng)裂隙燈顯微鏡檢查顯示屈光間質(zhì)透明，無眼前節(jié)病變。

1.1.2 主要試劑和儀器：DMEM/F12（Gibco，USA），胎牛血清（美國GIBCO），CO2培養(yǎng)箱（Hea1 ForceHF121UV），倒置相差顯微鏡（OLYMPUS CKX41，Japan），廣譜角蛋白單克隆抗體PCK（BOSTER公司）。

1.1.3 培養(yǎng)液的制備：采用DMEM/F12、10%胎牛血清、100×103U/L青霉素和100×103U/L鏈霉素，pH值7.2～7.4。

1.2 實驗方法

1.2.1 取材：取新西蘭白兔6只，以空氣栓塞法處死，無菌條件下迅速摘取12只眼球，用含有160× 103U慶大霉素的生理鹽水沖洗3～5次，備用。

1.2.2 原代培養(yǎng)兔角膜上皮細(xì)胞：在超凈工作臺上將眼球用含有慶大霉素的PBS沖洗3次，沿角膜緣取下完整角膜，用注射器輕劃角膜上皮表面，然后將角膜上皮面朝向培養(yǎng)皿鋪平，將培養(yǎng)皿置于37℃培養(yǎng)箱中，20 min后取出，加入培養(yǎng)基，培養(yǎng)基液面與角膜平齊。置37℃、5%CO2和95%空氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第2天補(bǔ)加少許培養(yǎng)液，3d后將角膜移至新培養(yǎng)皿中，再次貼與培養(yǎng)皿，置于培養(yǎng)箱20min后，再加入少許培養(yǎng)基，以獲得新的上皮細(xì)胞。每個角膜可以移3～4次。以后每周換液2～3次，每次換半液。

1.2.3 角膜上皮細(xì)胞的傳代：原代培養(yǎng)至上皮細(xì)胞80%融合后用PBS沖洗2次，加入0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA 1mL沖洗1次，再加入消化液1～2 mL，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞變圓，細(xì)胞間隙變大或少量細(xì)胞脫壁時加入含血清的培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞懸液，離心6～8min（1 000r/min），計數(shù)，接種于培養(yǎng)瓶中（按1∶2或1∶3傳代），3d后首次換液，以后每周更換2～3次，直至細(xì)胞完全融合。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色：兔角膜細(xì)胞培養(yǎng)在24孔板中，待細(xì)胞貼壁，移去角膜，吸出培養(yǎng)基，用多聚甲醛固定15min，用PBS浸泡3次，每次5min。加體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇溶液于玻片上，置室溫下處理20min后用PBS浸泡3次，每次5min，室溫下自然風(fēng)干。采用免疫組織化學(xué)ABC法染色，加入體積分?jǐn)?shù)為3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，在室溫下放置10min，PBS浸泡3次，每次5min。加入胎牛血清封閉，常溫下孵育10min，吸除多余血清；加入適當(dāng)濃度的PCK單克隆抗體，置于4℃過夜后吸去多余的液體，再用PBS浸泡3次，每次5min。加入適當(dāng)濃度的二抗IgG，室溫下放置1h后吸去多余的液體，用PBS浸泡3次，每次5min。DAB顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，加入雙蒸水終止，顯微鏡檢查并照像。

2 結(jié) 果

2.1 培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察：兔角膜上皮原代培養(yǎng)第2天，組織邊緣有細(xì)胞游出，細(xì)胞和細(xì)胞核均呈圓形，核位于細(xì)胞中央或旁中央?yún)^(qū)（圖1）；第3天，細(xì)胞呈扁平多邊形，相互連接成片（圖2）；第7天，局部可見懸浮細(xì)胞生長（圖3）；兔角膜上皮細(xì)胞第2代培養(yǎng)第2天，細(xì)胞生長旺盛，部分細(xì)胞貼壁呈片狀多邊形（圖4）。

2.2 兔角膜上皮細(xì)胞的鑒定：兔角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)3d，呈不規(guī)則多邊形生長。免疫組織化學(xué)染色顯示兔角膜上皮細(xì)胞對廣譜角蛋白單克隆抗體PCK免疫反應(yīng)較強(qiáng)，胞漿染色陽性（圖5）。

3 討 論

自20世紀(jì)50年代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)興起以來，角膜細(xì)胞的培養(yǎng)在國內(nèi)外已有不少報道，且培養(yǎng)技術(shù)一直不斷改進(jìn)［1-2］。有關(guān)眼表疾病的臨床前與臨床研究日益增多［3-4］，但以往關(guān)于角膜細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)存在方法復(fù)雜（如單層培養(yǎng)法）和培養(yǎng)條件昂貴（如需要在培養(yǎng)液中加入特殊生長因子）等問題。因此，尋求一種取材簡單、經(jīng)濟(jì)實用的培養(yǎng)方法，對眼表疾病、角膜病的基礎(chǔ)研究具有重要意義。

消化法是培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞的一種常見方法，操作過程簡便、培養(yǎng)周期短，但消化液的濃度及消化時間不易掌握，細(xì)胞活力易受到影響。研究［5］發(fā)現(xiàn)，分別使用消化培養(yǎng)法和組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)小鼠角膜上皮細(xì)胞，其中80%組織塊培養(yǎng)法的原代培養(yǎng)可成功傳代，而僅12%消化培養(yǎng)法原代培養(yǎng)可成功傳代；兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義。傳代培養(yǎng)中，組織塊培養(yǎng)法中55%P1細(xì)胞可以傳代超過P10并繼續(xù)穩(wěn)定傳代至少可傳至P25。而消化培養(yǎng)法傳代至P2即不能融合，認(rèn)為小鼠角膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)，組織塊培養(yǎng)法優(yōu)于消化培養(yǎng)法。本實驗采用全角膜片培養(yǎng)由組織塊培養(yǎng)法衍生而來不需添加其他試劑，實驗操作時間短，能夠很好地保持細(xì)胞活力，而且整個角膜片多次重復(fù)貼壁，能更大程度地增加獲得的上皮細(xì)胞數(shù)量。

組織塊貼壁法是一種較為傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，存在著方法復(fù)雜、細(xì)胞生長緩慢、周期長、細(xì)胞成分不單一等問題。也有研究采用全角膜培養(yǎng)法［6］培養(yǎng)上皮細(xì)胞，運(yùn)用機(jī)械刮除和差速貼壁相結(jié)合的方法進(jìn)行兔角膜上皮細(xì)胞的純化。本實驗采用全角膜培養(yǎng)，為了使角膜上皮細(xì)胞更好地游出和貼壁，用針頭輕劃角膜上皮，操作簡單，且不易混有成纖維細(xì)胞，能更好地減少對組織的損傷。在細(xì)胞原代培養(yǎng)和傳代的培養(yǎng)中，本研究中上皮細(xì)胞的形態(tài)和鑒定結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致［6］。

我們認(rèn)為本實驗可以用于對角膜細(xì)胞的離體實驗，可以為角膜離體疾病模型和角膜有關(guān)藥物研發(fā)提供研究對象。（本文圖見封二）

［1］KAUR H，CHAURASIA SS，AGRAWAL V，et a1.Expression of PDGF receptor-αin cornea1 myofibrob1asts in situ［J］. Experimenta1Eye Research，2009，89（3）：432-434.

［2］屈雷，敬曉棋，閆海龍，等.胎兒角膜上皮細(xì)胞分離方法的研究［J］.國際眼科雜志，2009，9（2）：250-253.

［3］AMBROSIORJR，KARA-JOSE N，WILSON SE.Ear1y keratocyte apoptosis after epithe1ia1 scrape injury in the human cornea［J］. Experimenta1Eye Research，2009，89（4）：597-599.

［4］MA P，WANG Z，PFLUGFELDER SC，et a1.To11-1ike receptors mediate induction of peptidog1ycan recognition proteins in human cornea1epithe1ia1 ce11s［J］.Experimenta1Eye Research，2010，90（1）：130-136.

［5］馬小力，劉漢強(qiáng).小鼠角膜上皮細(xì)胞消化培養(yǎng)法和組織塊培養(yǎng)法的比較研究［J］.國際眼科雜志，2011，11（6）：939-942.

［6］石妍，楊帆，葛紅巖，等.改良兔角膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)及純化的方法［J］.眼科新進(jìn)展，2010，30（7）：612-615.

（本文編輯：趙麗潔）

CULTURE OF RABBIT PRIMARY CORNEAL EPITHELIAL CELLS

WANG Dan1，3，LIYan2，SUN Guiyuan1*，WANG Zhuo3*
（1.Department of Histology and Embryology，the College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Experimental Teaching Center of Pharmacology，the School of Life Scienceand Biopharmaceutics，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China；3.Department of Pharmacology，HE's University，Shenyang 110163，China）

ObjectiveTo estab1ish a convenient，economic and pragmatic method for rabbit corhea1 epithe1ia1 ce11s primary cu1ture，and observe the bio1ogic characteristics of growth in vitro.MethodsThe rabbit cornea1 epithe1ia1 ce11s were cu1tured by the entire cornea1 tissue-cu1ture.The morpho1ogica1 characteristics of cu1tured ce11s were observed by inverted phase contrast microscope at various time periods respective1y and the cu1tured ce11swere identified by immunohistochemica1method.ResultsThe rabbit entire cornea adhered in 2 days，the ce11s cou1d be seen c1imbing out from the cornea11imbus.The ce11s and nuc1eiwere spherica1and nuc1eiwere 1ocated next to the centra1area or in the center；The epithe1ia1ce11s were f1at and po1ygona1and connected to each other into membrane in 3 days；Suspension of ce11growth can be seen 1oca11y in 7 days of primary cu1ture；The cornea1epithe1ia1 ce11s grew vigorous1y and some ce11swere adhered and were f1aky and po1ygona1on day 2 of passage 2. The cu1tured ce11s stained positive1y for monoc1ona1 antibody pan cytokeratin by immunohistochemica1 method.ConclusionThe entire cornea1 tissue-cu1ture is a simp1e convenient and practicab1e method for cu1turing cornea1epithe1ia1ce11swhich cou1d be seria11y subcu1tivated.

cornea；epithe1ia1ce11s；ce11cu1ture techniques；rabbit

Q813.11

A

1007-3205（2011）10-1117-03

2011-07-09；

2011-09-03

王丹（1974-），女，遼寧昌圖人，中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)博士研究生，從事神經(jīng)退行性相關(guān)疾病研究。

1*通訊作者。E-mai1：sungy2004@sohu.com

3*通訊作者。E-mai1：1uckzhuo1982@yahoo.com.cn

10.3969/j.issn.1007-3205.2011.10.001