薛 峰，李 晨，江 沛，王 多，任真明，潘思軼，王可興

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

高效液相色譜法測(cè)定蛋鴨組織中的類(lèi)胡蘿卜素

薛 峰，李 晨，江 沛，王 多，任真明，潘思軼，王可興*

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

通過(guò)響應(yīng)面分析法對(duì)蛋鴨肝臟組織中類(lèi)胡蘿卜素的提取方法進(jìn)行優(yōu)化。利用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察提取時(shí)間、提取溫度、皂化液質(zhì)量濃度對(duì)總類(lèi)胡蘿卜素提取率的影響。結(jié)果表明：蛋鴨肝臟組織中類(lèi)胡蘿卜素提取最優(yōu)條件為提取時(shí)間90min、提取溫度37℃、皂化液質(zhì)量濃度50g/100mL；建立的采用反相高效液相色譜測(cè)定蛋鴨肝臟組織和血清中類(lèi)胡蘿卜素的方法的檢出限為20ng/mL，在肝臟組織和血清樣品中的加標(biāo)回收率分別為95.21%和105.50%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.71%和6.73%。

蛋鴨；肝臟；血清

類(lèi)胡蘿卜素是一種脂溶性色素，其主要由細(xì)菌、霉菌、藻類(lèi)和綠色植物合成[1]。目前，在自然界中被鑒定的類(lèi)胡蘿卜素有600多種[2]。早期類(lèi)胡蘿卜素被認(rèn)為具有VA活性，然而近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的類(lèi)胡蘿卜素都不具備VA活性[3]。這些不具備VA活性的類(lèi)胡蘿卜素，除了可以清除自由基外，還可以降低患白內(nèi)障的風(fēng)險(xiǎn)[4]。但是，關(guān)于些類(lèi)類(lèi)胡蘿卜素在動(dòng)物體內(nèi)的降解途徑仍不清楚。因此，近年來(lái)國(guó)外的研究開(kāi)始集中于構(gòu)建合適的動(dòng)物模型，用以研究不具備VA活性的類(lèi)胡蘿卜素的生物代謝途徑。

與哺乳動(dòng)物一樣，禽類(lèi)自身不能合成類(lèi)胡蘿卜素，只能從食物中獲取[5]。通常，禽類(lèi)選擇性的富集含氧類(lèi)胡蘿卜素[6]。例如，Slifka等[7]研究發(fā)現(xiàn)，野生禽類(lèi)體內(nèi)只富集葉黃素、玉米黃質(zhì)、角黃素和隱黃質(zhì)。這一現(xiàn)象的產(chǎn)生，可能與禽類(lèi)的飲食結(jié)構(gòu)有關(guān)。禽類(lèi)大多以玉米或玉米制品為主要食物來(lái)源[8]。而在玉米和玉米制品中的類(lèi)胡蘿卜素主要為含氧類(lèi)胡蘿卜素[9]。因此，禽類(lèi)可能成為研究含氧類(lèi)胡蘿卜素在動(dòng)物體內(nèi)的吸收、運(yùn)輸和代謝的理想模型。

我國(guó)是禽蛋生產(chǎn)和消費(fèi)的大國(guó)[10]。禽蛋及其制品由于具有了良好的風(fēng)味和極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，一直深受人們的喜愛(ài)。禽蛋通常呈現(xiàn)黃色，是人體內(nèi)類(lèi)胡蘿卜素少數(shù)動(dòng)物性來(lái)源之一。因此，研究類(lèi)胡蘿卜素在蛋鴨體內(nèi)的富集機(jī)理，有助于更好地掌握天然色素在動(dòng)物體內(nèi)的富集規(guī)律，從而為人類(lèi)提供更具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的食物[11]。目前，尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道蛋鴨組織中類(lèi)胡蘿卜素的分析方法。因此，本實(shí)驗(yàn)在參照其他動(dòng)物組織類(lèi)胡蘿卜素分析方法[14]的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面優(yōu)化蛋鴨組織類(lèi)胡蘿卜素提取工藝，并建立蛋鴨組織中類(lèi)胡蘿卜素的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取14月齡的江南二號(hào)蛋鴨(由湖北省武漢市江夏區(qū)鴨場(chǎng)提供)為動(dòng)物模型。

正己烷(分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、甲基叔丁基醚(色譜純) 美國(guó)Tedia公司；β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞97%) 德國(guó)E.Merck公司。

1.2 儀器與設(shè)備

752紫外分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；高效液相色譜系統(tǒng)(配有二極管陣列檢測(cè)器和四元高壓梯度泵) 美國(guó)Waters公司；C30色譜柱(4.6mm×150mm，3μm) 愛(ài)爾蘭YMC公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

蛋鴨經(jīng)頸靜脈放血宰殺，取血樣和肝臟組織。肝臟組織用9g/L NaCl溶液清洗，擦干后放置于-76℃保存。血樣經(jīng)4℃、5000×g離心5min后，取血清置于-76℃保存。

1.3.2 肝臟組織中類(lèi)胡蘿卜素提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

關(guān)于動(dòng)物組織中類(lèi)胡蘿卜素的提取常采用高溫皂化的方法[12-13]。皂化的主要目的如下：第一，通過(guò)皂化可以使組織中的脂肪水解，從而純化用于分析檢測(cè)的類(lèi)胡蘿卜素樣品；第二，通過(guò)皂化可以使組織細(xì)胞完全破碎，從而提高類(lèi)胡蘿卜素的提取率；第三，通過(guò)皂化可以使組織內(nèi)酯化形式的類(lèi)胡蘿卜素游離出來(lái)，從而消除類(lèi)胡蘿卜素酯在分析過(guò)程中的干擾，實(shí)現(xiàn)對(duì)類(lèi)胡蘿卜素的準(zhǔn)確定性。例如Deming等[12]采用60℃、25min皂化來(lái)提取沙土鼠組織中的類(lèi)胡蘿卜素，White等[13]采用70℃、30min皂化來(lái)提取雪雕組織中類(lèi)胡蘿卜素。但是，在本實(shí)驗(yàn)室條件下，高溫皂化常常引起類(lèi)胡蘿卜素的異構(gòu)化和降解。因此，本實(shí)驗(yàn)采用較為溫和的條件進(jìn)行蛋鴨組織中類(lèi)胡蘿卜素的提取。

蛋鴨肝臟組織中類(lèi)胡蘿卜素提取過(guò)程簡(jiǎn)述如下：稱(chēng)取蛋鴨肝臟組織2g，加入5mL無(wú)水乙醇(含1g/L 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)，均質(zhì)后加入1mL一定質(zhì)量濃度的KOH溶液，進(jìn)行水浴皂化，皂化后的樣品迅速冷卻并加入3mL冷卻水，之后分別加入5mL正己烷進(jìn)行3次提取，合并提取液，將提取液在氮?dú)庵袚]干，加入2mL甲基叔丁基醚復(fù)溶樣品，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A樣。同時(shí)，取等量肝臟，均質(zhì)后加入正己烷多次提取，直至提取液為無(wú)色。合并提取液后在氮?dú)庵袚]干，用2mL甲基叔丁基醚復(fù)溶樣品，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A對(duì)照，并以此為完全提取的對(duì)照品。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取皂化時(shí)間、皂化溫度以及KOH質(zhì)量濃度為正交試驗(yàn)因素，以類(lèi)胡蘿卜素的提取率為考察指標(biāo)，選用3因素Box-Behnken[14]正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化肝臟類(lèi)胡蘿卜素提取方法(表1)。

表1 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平Table 1 Factors and levels in response surface analysis

1.3.3 提取率計(jì)算

1.3.4 肝臟組織中類(lèi)胡蘿卜素提取

提取條件按照正交得到的回歸模型預(yù)測(cè)的極值條件進(jìn)行提取，提取液在氮?dú)庵袚]干，最后用1mL無(wú)水乙醇復(fù)溶樣品，過(guò)0.22μm濾膜進(jìn)行高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)分析。

1.3.5 血清中類(lèi)胡蘿卜素提取

取血清2mL加入10mL無(wú)水乙醇(含1g/L 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)脫除蛋白質(zhì)，之后分別加入5mL正己烷進(jìn)行3次提取，合并提取液后將提取液在氮?dú)庵袚]干，最后用1mL無(wú)水乙醇復(fù)溶樣品，過(guò)0.22μm濾膜進(jìn)行HPLC分析。

1.3.6 色譜條件

C30色譜柱；采用二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，波長(zhǎng)為250～550nm；進(jìn)樣量50μL；柱溫25℃；流動(dòng)相、流速及梯度洗脫程序見(jiàn)表2。

表2 HPLC梯度洗脫程序Table 2 HPLC gradient conditions for carotenoids separation

2 結(jié)果與分析

2.1 肝臟組織類(lèi)胡蘿卜素提取正交試驗(yàn)

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)矩陣及類(lèi)胡蘿卜素得率結(jié)果見(jiàn)表3，對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理運(yùn)算，建立得率Y與調(diào)控因子X(jué)i之間的回歸方程式為：Y＝-761.67＋4.57X1＋13.61X2＋14.91X3-0.02X1X2＋0.01X1X3＋0.01X2X3-0.02-0.17-0.16。

表3 響應(yīng)面試程設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 3 The experimental design and corresponding results for response surface analysis

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of the fitted regression model

由表4可知，該方程對(duì)試驗(yàn)擬合情況好(模型P＜0.0001)，試驗(yàn)誤差小，因此可用該回歸方程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。同時(shí)，軟件分析得到失擬項(xiàng)P值為0.5789＞0.05，未達(dá)到顯著水平，且決定系數(shù)R2＝0.9740，表明試驗(yàn)設(shè)計(jì)合理。在一次項(xiàng)中，皂化時(shí)間(X1)對(duì)肝臟組織類(lèi)胡蘿卜素提取率影響達(dá)到顯著水平(P＜0.05)，皂化液質(zhì)量濃度(X3)對(duì)提取率影響極顯著，皂化溫度(X2)影響不顯著，二次項(xiàng)均對(duì)肝臟組織類(lèi)胡蘿卜素提取率影響達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)。交互項(xiàng)中皂化時(shí)間和皂化溫度的交互作用對(duì)肝臟組織類(lèi)胡蘿卜素提取率影響顯著?；貧w模型預(yù)測(cè)的肝臟組織類(lèi)胡蘿卜素提取率的極值條件為皂化時(shí)間93.77min、皂化溫度37.57℃、皂化液質(zhì)量濃度53.33g/100mL，此條件下的提取率為106.08%。對(duì)方程預(yù)測(cè)值進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，即皂化時(shí)間90min、皂化溫度37℃、皂化液質(zhì)量濃度50g/100mL，3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值為(102.13±2.32)%，與理論值接近，表明該模型能夠反映預(yù)期優(yōu)化。

2.2 肝臟組織與血清類(lèi)胡蘿卜素高效液相色譜分析

肝臟組織和血清HPLC色譜圖見(jiàn)圖1，其主要類(lèi)胡蘿卜素的光譜圖見(jiàn)圖2。根據(jù)保留時(shí)間，二極管陣列檢測(cè)器掃描圖譜獲得類(lèi)胡蘿卜素的特征吸收以及與標(biāo)準(zhǔn)品的比對(duì)，參考文獻(xiàn)[16-18]等，初步推斷肝臟組織中主要類(lèi)胡蘿素為葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-胡蘿卜素。血清中只檢測(cè)到葉黃素和玉米黃質(zhì)。由圖1可知，采用該方法可以將類(lèi)胡蘿卜素與其他脂溶性成分以及類(lèi)胡蘿卜素的降解產(chǎn)物很好的分離。

圖1 肝臟組織(A)和血清(B)的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of duck liver and serum samples

圖2 肝臟組織和血清中主要類(lèi)胡蘿卜素光譜圖Fig.2 UV scanning spectra of carotenoids in duck liver and serum

圖3 肝臟組織(A)和血清(B)加標(biāo)(2μg/mL)后的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of duck liver tissue and serum samples with the addition ofβ-carotene (2μg/mL)

2.3 分析方法評(píng)價(jià)

2.3.1 回歸方程和檢出限

將β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品用無(wú)水乙醇配制成8個(gè)質(zhì)量濃度梯度的工作液，質(zhì)量濃度范圍為0.05～15.00μg/mL。將各質(zhì)量濃度工作液按照上述HPLC條件進(jìn)行分析，以峰面積為橫坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，可得回歸方程Y＝6×10-6X＋0.0183(R=0.9995)?？梢?jiàn)采用該色譜條件，在0.02～15.00μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系。因此，可以采用此色譜條件對(duì)該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的樣品進(jìn)行分析。

對(duì)上述工作液繼續(xù)稀釋并進(jìn)行HPLC分析，直到信噪比為3時(shí)，記錄所進(jìn)樣品質(zhì)量濃度，即為該方法的檢出限。本方法所測(cè)檢出限為20ng/mL。

2.3.2 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

分別在肝臟組織和血清中添加1mL上述8個(gè)質(zhì)量濃度梯度的β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)[18]。圖3為添加2μg/mL β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品溶液時(shí)肝臟組織和血清的高效液相色譜圖?；厥章蕼y(cè)定結(jié)果顯示：肝臟組織加標(biāo)回收率平均值為95.21%，血清加標(biāo)回收率平均值為105.50%。由此可知，由于肝臟組織需要皂化處理，在皂化過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致部分類(lèi)胡蘿卜素的損失[20]。

2.3.3 精密度實(shí)驗(yàn)

在肝臟組織和血清中加入2μg/mL β-胡蘿卜素工作液1mL，然后在同1d內(nèi)重復(fù)5次測(cè)定β-胡蘿卜素的含量，用以檢測(cè)樣品測(cè)定時(shí)的重現(xiàn)性[21]。結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，在肝臟組織和血清樣品測(cè)試中，其精密度分別為5.71%和6.73%。由此可知，該方法在1d內(nèi)測(cè)定的重現(xiàn)性較好。

表5 肝臟組織和血清中β-胡蘿卜素測(cè)定精密度Table 5 Precision of carotenoids determination in duck liver and serum by the established HPLC method

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)正交試驗(yàn)得出蛋鴨肝臟組織中類(lèi)胡蘿卜素提取的最優(yōu)條件，即皂化時(shí)間90min、皂化溫度37℃、皂化液質(zhì)量濃度50g/100mL。通過(guò)皂化處理，樣品在乙醇中溶解性良好，類(lèi)胡蘿卜素的提取率較多次均質(zhì)提取提高了2.13%，且在色譜圖中未檢測(cè)到類(lèi)胡蘿卜素酯類(lèi)物質(zhì)。并在此基礎(chǔ)上建立了蛋鴨肝臟組織和血清組織中類(lèi)胡蘿卜素的分析方法。蛋鴨肝臟組織中主要類(lèi)胡蘿卜素為葉黃素、玉米黃質(zhì)以及β-胡蘿卜素，而血清中只檢測(cè)到葉黃素和玉米黃質(zhì)。此外，通過(guò)對(duì)該方法的評(píng)價(jià)可知：此方法在0.05～15.00μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性度；此方法的檢出限為20ng/mL；肝臟組織和血清樣品的回收率分別為95.21%和105.50%；肝臟組織和血清樣品測(cè)定的精密度分別為5.71%和6.73%。

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Analysis of Carotenoids in Laying Duck Tissues Using High Performance Liquid Chromatography

XUE Feng，LI Chen，JIANG Pei，WANG Duo，REN Zhen-ming，PAN Si-yi，WANG Ke-xing*
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

With the aim of developing an optimal sample preparation method for the determination of carotenoids in laying duck liver tissues by high performance liquid chromatography, response surface methodology was employed to optimize the extraction recovery of carotenoids from laying duck liver tissues with respect to three extraction conditions such as temperature, extraction time and KOH concentration. The optimal extraction conditions were achieved as follows∶ extraction time 90 min, temperature 37 ℃ and KOH concentration 50 g/100 mL. The HPLC method established based on these extraction conditions exhibited a detection limit of 20 ng/mL for carotenoids in the liver and serum laying duck. The mean spike recovery rates for carotenoids in the liver tissues and serum laying duck were 95.21% and 105.50% with a relative standard deviation (RSD) of 5.71% and 6.73%, respectively.

egg-laying duck；liver；serum

Q584

A

1002-6630(2011)14-0185-05

2011-01-03

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(30972044)

薛峰(1985—)，男，博士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。E-mail：xuefengscholar@126.com

*通信作者：王可興(1963—)，男，工程師，本科，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。E-mail：wangkx@mail.hzau.edu.cn