李 華 楊卉娟 柯華昕 陳俊英 潘 玥 趙玉嬌 孫強(qiáng)明 馬紹輝

柯薩奇病毒B5(coxsackie virus B5，CVB5)感染可引起多種人類疾病，包括無菌性腦膜炎、肌肉麻痹、病毒性心肌炎、手足口病、胰腺炎和糖尿病等，在我國均有報道［1～4］。

CVB5屬于腸道病毒屬小核糖核酸病毒，無包膜、單股正鏈RNA，病毒基因組由7402個堿基構(gòu)成，基因組順序依次為5'端非編碼區(qū)，P1、P2、P3區(qū)和一段3'端非編碼區(qū)，其中P1區(qū)編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，即衣殼蛋白(capsule protein)，分別為VP1、VP2、VP3和VP4，而病毒主要的免疫原性蛋白和中和抗原位點在VP1上［1，3～5］。

為了解2009年引起無菌性腦膜炎的病原分離株KMA193－09(基因登陸號為HQ423145)的遺傳特性，我們對其VP1基因片段進(jìn)行擴(kuò)增及分析，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

材料與方法

1.材料:(1)細(xì)胞:Hep－2、RD細(xì)胞皆由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所檢定室保存并提供。(2)標(biāo)本來源:昆明市兒童醫(yī)院腦炎疑似病例(年齡)的糞便標(biāo)本。(3)RNA提取試劑盒:Axygen Body Fluid viral DNA/RNA Miniprep Kit.lot: KC50090501－B－G。(4)RT－PCR Kit:TAKARA One step RT－PCR Kit VER.2203.lot:BK1101。

2.方法:(1)病毒分離::采用組織培養(yǎng)法，取糞便標(biāo)本1g，加入5ml0.01mol/L PBS(pH7.4)制成懸液，3000r/min，離心30min，用0.45μl濾器除菌過濾，接種已長成致密單層的Hep－2、RD細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)嚴(yán)格按WHO分離腸道病毒規(guī)程操作，于37℃培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%小牛血清的MEM［6］。觀察病毒在細(xì)胞上的細(xì)胞病變情況(CPE)，如果無CPE，盲傳3代;3代后無CPE出現(xiàn)，判為陰性。病毒繼續(xù)在RD細(xì)胞培養(yǎng)增殖2代。(2)病毒核糖核酸(RNA)提取:采用Axygen Body Fluid viral DNA/RNA Miniprep Kit，按試劑盒說明書提取病毒RNA。(3)引物:擴(kuò)增與測序引物參照文獻(xiàn)［7］:腸道病毒公用引物見表1。擴(kuò)增片段長度為831bp，引物由上海生物工程有限公司合成。(4)反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)(RT－PCR):采用TaKaRa公司生產(chǎn)的One－step RNA PCR kit(AMV)試劑盒。反應(yīng)條件:50℃ 30min，反轉(zhuǎn)錄 95℃ 2min后94℃ 30s，51℃ 30s，72℃ 1.5min，循環(huán)39次，72℃延伸7min，然后轉(zhuǎn)入4℃。取擴(kuò)增產(chǎn)物5μl，用1.0%瓊脂糖電泳，根據(jù)Marker位置對擴(kuò)增片段進(jìn)行確認(rèn)。(5)序列測定和數(shù)據(jù)分析:擴(kuò)增陽性的PCR產(chǎn)物由北京三博生物技術(shù)有限公司進(jìn)行純化和序列測定。其他有關(guān)CVB5的VP1序列從NCBI的基因數(shù)據(jù)庫(Genbank)上下載，并采用瑪格。Mega 4.0軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析處理。

表1 用于RT－PCR的引物

結(jié)果

1.病毒分離:將直接從臨床樣品中鑒定為CVB5的3例無菌性腦膜炎患兒的糞便標(biāo)本，分別接種RD和Hep－2細(xì)胞后，僅培養(yǎng)分離到一個陽性分離物，收集上清，并保存在－70℃。

2.病毒分離株VP1序列測定:將陽性培養(yǎng)物上清，采用特異性引物作RT－PCR擴(kuò)增，均能擴(kuò)增出柯薩奇B5病毒的831bp特異性核酸片段;對PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因序列的測定，將結(jié)果輸入 Genbank，用BLAST檢索比對，進(jìn)一步證實該分離株為柯薩奇B5病毒。

3.柯薩奇B5病毒分離株VP1基因核苷酸和氨基酸分析:VP1基因核苷酸和氨基酸同源性比較分別顯示:KMA193－9與其他Cox.B5病毒分離株核苷酸同源性在85.4% ～95.7%之間，氨基酸同源性在95.67%～98.19%之間(表2)。KMA193－9在氨基酸上與其他分離株存在5個位點的差異，它們分別是3號位點由P變?yōu)門、95位點由S變?yōu)镹、164位點由S變?yōu)門、188位點由G變?yōu)镃、200位點由R變?yōu)镵 (圖1)。

表2 KMA193－09分離株VP1基因核苷酸和氨基酸同源性比較(%)

4.柯薩奇B5病毒分離株VP1基因進(jìn)化樹分析:將不同時期、不同國家和地區(qū)的柯薩奇B5病毒采用DNAStar軟件，構(gòu)建基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。結(jié)果顯示，KMA193－09分離株(基因登錄號HQ423144)與YZ081－SD－CHN－2005－CB5株形成一進(jìn)化分支。與我國的其余柯薩奇B5分離株有一定的距離，與CB5－SD－sewage－090705－2－3H分離株共同形成一個較大的分支，而與1603Finland82株、CF219051－06株距離遠(yuǎn)。

圖1 KMA193－09分離株VP1區(qū)氨基酸序列比較

圖2 KMA193－09病毒分離株VP1基因進(jìn)化樹

討論

腸道病毒的VP1基因不僅是病毒的主要表面抗原的決定簇區(qū)，而且具有與病毒血清型完全對應(yīng)的遺傳多樣性，目前作為腸道病毒屬內(nèi)不同血清型分類依據(jù)，以及小RNA病毒科內(nèi)不同屬的分類參考。因此選擇CVB5 VP1區(qū)來分析病毒變異和進(jìn)化關(guān)系。

本次CVB5病毒分離中，首先用RT－PCR方法檢測采集的臨床樣品，由于RT－PCR方法具有快速、靈敏、特異等特點，所以檢測出3個CVB5病毒樣品［8，9］。當(dāng)接種Hep－2、RD細(xì)胞后，僅分離得到一株CVB5病毒，提示PCR法比細(xì)胞分離更靈敏，這與文獻(xiàn)［10］報道的一致。

通過對KMA193－09病毒分離株VP1基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹圖可以看出，KMA193－09病毒分離株與中國及其他亞洲的病毒分離株距離較近，而與芬蘭、法國等分離株距離較遠(yuǎn)。而序列分析也顯示，KMA193－09分離株與其他中國分離株之間也顯示出一定差異。以上這提示CVB5病毒存在明顯的地域分布性。

曾有報道CVB5病毒在鼠胰腺連續(xù)傳代15代，發(fā)現(xiàn)表型發(fā)生改變并引起小鼠似糖尿病綜合征，而親代病毒損害腺泡組織有限卻3天后胰腺感染跡象消失［11］。通過測序和分析發(fā)現(xiàn)全基因序列出10個突變，導(dǎo)致8個氨基酸突變，其中在VP1出現(xiàn)N95S突變;而后研究人員進(jìn)一步通過反向遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)VP1氨基酸V 94 I突變使CVB5更好適應(yīng)胰島β細(xì)胞株MIN－6細(xì)胞，認(rèn)為該位點更重要［11］。而本研究中KMA193－09 VP1的94和95位氨基酸分別為I及N，這提示該分離株也能較好的在MIN－6細(xì)胞增殖。

另外，CVB5病毒在VP1的288位氨基酸，除CF219051－06為賴氨酸(K)外，KMA193－09與其他病毒分離株均為谷氨酸(E)，該位置位于病毒體的表面，賴氨酸為堿性氨基酸，而谷氨酸為酸性氨基酸，這種突變的改變是否影響病毒吸附于細(xì)胞表面還有待于進(jìn)一步的研究［8］。

本研究闡明了CVB5病毒KMA193－09分離株結(jié)構(gòu)蛋白VP1的基因序列，并對其變異性及與其他CVB5的關(guān)系進(jìn)行了分析，為今后CVB5的基因庫和分子流行病的調(diào)查研究提供一定的資料及試驗依據(jù)。

1 金奇.醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，2001:579－602

2 趙國華，許汴利，朱謙，等.一起柯薩奇B5病毒感染引起疾病暴發(fā)的流行病學(xué)調(diào)查［J］.中國初級衛(wèi)生保健，2006，20(8):25－26

3 葛瓊，嚴(yán)菊英，龔黎明，等.浙江省2008年病毒性腦膜腦炎病原柯薩奇B組5型病毒VP1區(qū)基因變異分析［J］.中國疫苗和免疫，2010，16(1):38－43

4 趙月萍，馬明英，王建軍，等.一起爆發(fā)型柯薩奇病毒性腦炎的病原分離與鑒定［J］.安徽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2001，7(6):401－402

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6 世界衛(wèi)生組織(WHO)擴(kuò)大免疫規(guī)劃和傳染性疾病部.脊髓灰質(zhì)炎病毒檢測手冊［R］.1992

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10 Mark H，Sawyer MD.Enterovirus infections:diagnosis and treatment［J］.Current Opinion in Pediatrics，2001，13:65－69

11 Al－Hello H，Davydova B，Smura T，et al.Phenotypic and genetic changes in coxsackievirus B5 following repeated passage inmouse pancreas in vivo［J］.Med Virol，2005，75(4):566－574