高冬芳，張逸波，凌欽婕，鄒 穎，黃 峙*

(暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510632)

富硒螺旋藻多肽對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的抑制作用

高冬芳，張逸波，凌欽婕，鄒 穎，黃 峙*

(暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510632)

從富硒螺旋藻(SeSP)中提取總蛋白(SeSP-TP)，用不同蛋白酶水解SeSP-TP制備富硒螺旋藻多肽(SeSP-Ps)，體外測定SeSP-Ps對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的抑制作用。結(jié)果表明：5種常見蛋白酶在最適條件下對SeSP-TP水解度明顯不同，其中胃蛋白酶-胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶聯(lián)合使用時的酶水解度最高；雖然不同蛋白酶水解制備的SeSP-Ps均對ACE具有較強(qiáng)的抑制作用，但不同酶水解的SeSP-Ps對ACE的50%抑制濃度(IC50)存在明顯差異，其中胃蛋白酶-胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶聯(lián)合酶解制備的SeSP-Ps對ACE的IC50值最低，為74.6μg/mL。結(jié)果提示：SeSP在體內(nèi)經(jīng)胃腸蛋白酶消化產(chǎn)生的多肽，對ACE具有較強(qiáng)的抑制活性，且SeSP-Ps對ACE的抑制作用呈現(xiàn)顯著的劑量-效應(yīng)依賴性。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)；螺旋藻；硒；多肽

螺旋藻(Spirulina platensis，SP)具有預(yù)防心腦血管疾病、抗腫瘤、抗病毒等輔助藥用價值[1]。硒(selenium，Se)是人體必需微量元素之一，缺硒與克山病、糖尿病、腫瘤等數(shù)10種疾病有關(guān)。SP是無機(jī)硒生物有機(jī)化的理想載體[2-4]，前期的研究證實了富硒螺旋藻(selenium enriched Spirulina platensis，SeSP)、SeSP總蛋白(SeSP-TP)和硒藻藍(lán)蛋白(Se phycocyanin，Se-PC)具有拮抗肝損傷和纖維化及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等方面的生物學(xué)活性，發(fā)現(xiàn)含硒蛋白質(zhì)是SeSP中的主要活性組分[5-10]。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin convert enzyme，ACE)催化血管緊張素Ⅰ生成血管緊張素Ⅱ，使小動脈血管平滑肌收縮，引起血壓迅速上升[11]。抑制ACE的活性，可以有效阻止血管緊張素Ⅱ的生成，從而達(dá)到降壓作用。近年來，研究者已證實食品不同來源的ACE抑制多肽有250余種[12-14]。本研究從SeSP中提取SeSP-TP，用不同蛋白酶水解SeSP-TP制備富硒螺旋藻多肽(SeSP peptides，SeSP-Ps)，體外測定SeSP-Ps對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis Nordst. Geitler)藻種取自暨南大學(xué)水生生物研究所。

胃蛋白酶(pepsin，2500U/mg)、胰蛋白酶(trypsin，10000U/mg)、木瓜蛋白酶(papain，200U/mg)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin，1500U/mg)、堿性蛋白酶(alcalase，200U/mg)、馬尿酰-組胺酰-亮氨酸(Nhippuryl-His-Leu hydrate，HHL)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE，10U/mg) 美國Sigma公司；BCA法蛋白質(zhì)定量試劑盒、HEPES和PBS緩沖液 鼎國生物技術(shù)公司；亞硒酸鈉、丙酮、乙酸乙酯等試劑均為分析純。實驗全部采用Milli Q水。

LRH-250-B型光照培養(yǎng)箱、TGL-16G型冷凍高速離心機(jī) 上海醫(yī)用分析儀器廠；JY92-IID型超聲細(xì)胞破碎儀 湖北泰維醫(yī)療科技公司；S54型紫外-可見分光光度計 廣州光學(xué)儀器廠。

1.2 富硒螺旋藻(SeSP)的培養(yǎng)

采用Zarrouk培養(yǎng)基培養(yǎng)保種[2]。取對數(shù)生長期的鈍頂螺旋藻藻種，接種于5L鼓泡培養(yǎng)瓶內(nèi)，接種量為OD560nm值為0.10。培養(yǎng)條件：溫度33～35℃，pH8.8～9.5，光照強(qiáng)度4000lx，光照時間16h/d。在培養(yǎng)周期的第7、8、9天，分3次等量加入200μg/L亞硒酸鈉。第10天過濾收集藻細(xì)胞。

1.3 富硒螺旋藻水溶性總蛋白(SeSP-TP)的提取

取藻細(xì)胞25g，加入120mL PBS緩沖液(pH7.2)，反復(fù)凍融3次，冰浴超聲破碎30min(5s破碎，10s間隔；功率800W)，12000×g離心30min去掉細(xì)胞碎片，5倍體積-20℃預(yù)冷丙酮沉淀過夜，12000×g離心15min收集沉淀蛋白，冰浴待丙酮揮發(fā)干凈后，加入1mL PBS復(fù)溶。采用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度[9]。

1.4 富硒螺旋藻蛋白多肽(SeSP-Ps)的制備

取1mg SeSP-TP加入0.3U蛋白酶進(jìn)行酶解，經(jīng)大量預(yù)實驗，不同蛋白酶的最適酶解條件如表1所示。胃蛋白酶-胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶聯(lián)合水解方案：先用胃蛋白酶在37℃、pH1.5條件下水解6h，再用胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶酶活力比為10:1的比例在37℃、pH7.5條件下水解6h[13]。水解過程中采用0.1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值。水解結(jié)束，沸水浴15min終止反應(yīng)。用截留分子質(zhì)量為10kD的超濾管超濾所有酶解樣品，冷凍干燥，得SeSP-Ps。

表1 不同蛋白酶水解SeSP-TP的最適條件Table 1 Optimal conditions for SeSP-TP hydrolysis by different proteases

1.5 蛋白酶水解度(hydrolysis degree，HD)的測定

采用水解后多肽的質(zhì)量與水解前蛋白質(zhì)的質(zhì)量之間的比值作為蛋白酶水解度。多肽質(zhì)量濃度測定方法如下，調(diào)整SeSP-Ps及對照組的稀釋倍數(shù)，分別測定215nm和225nm波長處的吸光度，根據(jù)文獻(xiàn)[13]計算多肽質(zhì)量濃度。

1.6 ACE抑制率測定

ACE活性測定方法參見文獻(xiàn)[12]，將20μL SeSP-Ps、0.3mU ACE、20μL緩沖溶液(HEPE-NaCl緩沖液，50mmol/L，pH8.3，含300mmol/L NaCl)，37℃孵化15min。加入20μL 6.5mmol/L HHL，37℃孵化1h后用1mol/L的HCl終止反應(yīng)。加入200μL乙酸乙酯萃取反應(yīng)產(chǎn)物馬尿酸(Hip)，取上層150μL，減壓離心(40℃、真空度0.090MPa)去除乙酸乙酯，固體用500μL Milli Q水溶解，測228nm波長處的光吸收度(產(chǎn)物馬尿酸在228nm波長處有特征吸收峰)。SeSP-Ps對ACE的抑制率按式(2)計算。

1.7 硒含量檢測

參照文獻(xiàn)[15]的方法，將100mg的樣品混合5mL的消化液(濃硝酸:高氯酸體積比3:1)，200℃消化6h，待溶液完全澄清之后停止，12000×g離心去沉淀。用Milli Q水稀釋到5mL，用ICP-AES測定硒含量。

1.8 統(tǒng)計分析

所有實驗重復(fù)3次。結(jié)果以x±s表示，統(tǒng)計分析采用SPSS 13.0處理，進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SeSP和SeSP-TP中Se含量

如圖1所示，SeSP和SeSP-TP中硒含量分別為402μg/g和314μg/g，說明SeSP代謝轉(zhuǎn)化的硒75%以上存在于藻體蛋白質(zhì)中，也提示SeSP-TP經(jīng)酶解后可獲得含硒的水解多肽。

圖1 SeSP和SeSP-TP中硒含量Fig.1 Se concentrations of SeSP and SeSP-TP

2.2 不同蛋白酶對SeSP-TP的水解度

圖2 不同蛋白酶對SeSP-TP的水解度Fig.2 Time courses of hydrolysis degree of SeSP-TP by different proteases

如圖2所示，5種蛋白酶對SeSP-TP的水解度依次為：堿性蛋白酶(alcalase)＞胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)＞木瓜蛋白酶(papain)＞胃蛋白酶(pepsin)＞胰蛋白酶(trypsin)。雖然胰蛋白酶和胃蛋白酶對SeSP-TP的水解度較低，分別為37.1%和36.4%，但是，當(dāng)胃蛋白酶-胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶聯(lián)合使用時對SeSP-TP的水解度最高，可以達(dá)到81.2%，且持續(xù)時間長。胃蛋白酶-胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶聯(lián)合使用模擬了人體消化道酶系統(tǒng)，說明SeSP-TP可被人體消化利用的效率很高，明顯優(yōu)于其他體外蛋白酶單獨(dú)作用，因此，SeSP產(chǎn)品無需體外酶解，是一種優(yōu)質(zhì)功能性食品，具有強(qiáng)大的應(yīng)用潛力。在整個水解過程中，隨著水解度的升高，水解速率逐漸減低，符合蛋白酶水解過程中由于底物被分解而造成的反應(yīng)平衡變化的規(guī)律。

2.3 SeSP-Ps對ACE的抑制率

圖3 螺旋藻蛋白水解多肽對ACE的抑制率Fig.3 ACE inhibition rates of SeSP-Ps hydrolysates obtained with different proteases

如圖3所示，5種蛋白酶水解多肽對ACE抑制率依次為：木瓜蛋白酶＞胃蛋白酶＞堿性蛋白酶＞胰凝乳蛋白酶＞胰蛋白酶，富硒和未富硒螺旋藻總蛋白的酶水解多肽SeSP-Ps和SP-Ps對ACE的抑制作用具有相似的趨勢，且SeSP-Ps對ACE的抑制率均高于SP-Ps，其中胃蛋白酶水解多肽SeSP-Ps對ACE的抑制率明顯高于SP-Ps (P＜0.05)。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，胃蛋白酶-胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶聯(lián)合水解的SeSP-Ps對ACE抑制率最高(89.5%)，明顯高于相同酶解條件下的水解多肽SP-Ps對ACE的抑制率(72.2%)。結(jié)果表明蛋白酶水解多肽對ACE抑制率與上述結(jié)果中的水解度相一致，胃蛋白酶-胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶聯(lián)合水解，較好地模擬了人體消化道酶系統(tǒng)，提示SeSP-TP經(jīng)人體消化利用后，可產(chǎn)生對ACE具有較強(qiáng)抑制作用的活性多肽。因此，SeSP作為防治高血壓和心腦血管的保健食品具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.4 SeSP-Ps抑制ACE的劑量效應(yīng)

圖4 胃蛋白酶-胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶聯(lián)合水解多肽抑制ACE的劑量效應(yīng)關(guān)系Fig.4 Dose dependence of ACE inhibition activity of SeSP-Ps hydrolysate obtained by the combined use of pepsin, trypsin and chimotrypsin

從圖4可見，胃蛋白酶-胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶聯(lián)合水解的SeSP-Ps對ACE的抑制具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，推算SP-Ps和SeSP-Ps的IC50值分別是139.8μg/mL和74.6μg/mL，差異明顯。當(dāng)多肽質(zhì)量濃度在200μg/mL以下時，SP-Ps和SeSP-Ps對ACE抑制效率差異不顯著，而當(dāng)多肽質(zhì)量濃度高于200μg/mL時，SP-Ps和SeSP-Ps的ACE抑制效率差異極顯著(P＜0.01)。另外，用ICPAES測定SeSP-TP和SeSP-Ps中Se含量分別為314μg/g和293μg/g，兩者差別較小。結(jié)果說明，在SeSP-Ps制備過程中硒的損失不大；另外，當(dāng)多肽質(zhì)量濃度小于200μg/mL時，其中所含Se的質(zhì)量濃度為0.06μg/mL，可能很難發(fā)揮其作用，造成SP-Ps和SeSP-Ps的ACE抑制效率差異很小。隨著SeSP-Ps質(zhì)量濃度的增加，Se含量也隨之上升，Se則可能參與對ACE的抑制作用，導(dǎo)致SeSP-Ps在高濃度時對ACE的抑制效率顯著高于SP-Ps。

3 結(jié) 論

研究了5種蛋白酶水解SeSP-TP的效率及其水解多肽對ACE的抑制作用，并進(jìn)一步探討了最優(yōu)酶解方案的水解多肽抑制ACE的劑量效應(yīng)和IC50值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用模擬人體內(nèi)消化道胃蛋白酶-胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶聯(lián)合水解方案對SeSP的水解度最高，其水解多肽SeSP-Ps對ACE的抑制最強(qiáng)，IC50值為74.6μg/mL，SeSP-Ps對ACE的抑制作用呈現(xiàn)顯著的劑量-效應(yīng)依賴性。

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Angiotensin Convert Enzyme Inhibition of Peptides Derived from Water Soluble Total Protein of Selenium-enriched Spirulina platensis

GAO Dong-fang，ZHANG Yi-bo，LING Qin-jie，ZOU Ying，HUANG Zhi*
(College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

The water soluble total protein (TP) of selenium-enriched Spirulina platensis (SeSP), named as SeSP-TP, was extracted by phosphate buffer and then hydrolyzed by 5 different proteases to produce SeSP peptides (SeSP-Ps). The angiotensin convert enzyme (ACE) inhibition of SeSP-Ps was measured in vitro. The results showed that treatments with different proteases caused obvious difference of hydrolysis degree (HD) to SeSP-TP, and the combined use of pepsin, trypsin and chimotrypsin led to the highest H. Furthermore, we found that all SeSP-Ps produced by various proteases could inhibit ACE. The 50% ACE inhibition concentration (IC50) of SeSP-Ps derived from the combination of pepsin, trypsin and chimotrypsin was 74.6μg/mL, which was the lowest in comparison with SeSP-Ps obtained with each of the three enzymes or papain. The present results implied that the excellent functional food SeSP contains highly active dose-dependent ACE inhibition peptides.

angiotensin convert enzyme；Spirulina platensis；selenium；peptide

TS201.6

A

1002-6630(2011)07-0007-04

2010-07-04

國家自然科學(xué)基金項目(20975045；20675045)；暨南大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新工程項目(cx10088)

高冬芳(1988—)，女，本科生，研究方向為天然產(chǎn)物抗高血壓活性。E-mail：2007051587@stu.jnu.edu.cn

*通信作者：黃峙(1968—)，男，副教授，博士，研究方向為砷、硒等元素的活性形態(tài)及其作用機(jī)制。

E-mail：thsh@jnu.edu.cn