張榮升,鄢明華,張國偉,張 莉

(1.天津農(nóng)學(xué)院,天津 300384;2.天津市畜牧獸醫(yī)研究所,天津 300112)

NASBA技術(shù)及其在畜禽病毒檢測中的應(yīng)用*

張榮升1,2,鄢明華1*,張國偉1,張 莉1

(1.天津農(nóng)學(xué)院,天津 300384;2.天津市畜牧獸醫(yī)研究所,天津 300112)

NASBA即核酸序列依賴擴(kuò)增技術(shù),主要用于擴(kuò)增RNA,是由一對特異性的引物介導(dǎo)的、連續(xù)均一的、體外核酸序列等溫擴(kuò)增反應(yīng)過程。該技術(shù)具有操作簡便,特異性強(qiáng),敏感性高,快速,高通量等優(yōu)點,目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于人類與動物的多種病毒性疾病的檢測,具有良好的應(yīng)用前景。在禽流感病毒、新城疫病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、口蹄疫病毒等的檢測中均表現(xiàn)出了很高的敏感性和特異性。論文簡要介紹了NASBA技術(shù)的原理,特點以及在畜禽病毒檢測中的應(yīng)用,旨為病毒檢測技術(shù)提供新的途徑。

NASBA;原理;病毒檢測

當(dāng)前,畜禽病毒性疾病盛行,病毒變異在加速,而且普遍存在幾種病毒的混合感染,給畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的損失[1]。因此,針對病毒性的傳染病,需要快速,準(zhǔn)確,簡便的診斷方法,以便在第一時間內(nèi)迅速的判斷出疾病病原,采取有效的控制措施,最大限度的降低損失?？焖?、準(zhǔn)確、定期的對畜禽群體健康狀況和養(yǎng)殖環(huán)境進(jìn)行監(jiān)測可以防患于未然,為養(yǎng)殖業(yè)保駕護(hù)航。NASBA(nucleic acid sequencebased amplification)技術(shù)于1991年由Compton J報道[2],是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項新的核酸擴(kuò)增技術(shù)。在42℃條件下2 h左右可將模板RNA擴(kuò)增約l09～1012倍。其特點是操作簡單,不需要特殊儀器,不需要溫度循環(huán),整個反應(yīng)過程由3種酶控制,循環(huán)次數(shù)少,忠實性高。基于這些優(yōu)點,在獸醫(yī)領(lǐng)域,已經(jīng)應(yīng)用于禽流感[22]、新城疫[23]、藍(lán)耳病[5]、傳染性胃腸炎[24]等疾病的診斷和檢測,這一技術(shù)在獸醫(yī)傳染病監(jiān)測和診斷方面具有良好的應(yīng)用前景。

1 NASBA擴(kuò)增反應(yīng)原理

NASBA擴(kuò)增反應(yīng)技術(shù)是由一對特異性的引物引導(dǎo)的等溫條件下的核苷酸序列的體外擴(kuò)增,該反應(yīng)由3種酶控制完成:禽源成髓細(xì)胞瘤逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶H和T7RNA聚合酶。反應(yīng)體系除了以上3種酶外還包括:核糖核苷三磷酸、脫氧核糖核苷三磷酸、一對特殊引物及各種緩沖液等。引物P1的5′末端含有能被 T7 RNA聚合酶識別的啟動子序列[4]。

整個反應(yīng)分為兩相:在非循環(huán)相,引物P1與模板RNA退火,在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下形成RNA:DNA雜交鏈,RNaseH隨后水解掉雜交鏈上的RNA鏈,留下一條單鏈DNA。引物P2隨后與這條DNA鏈的5′末端退火,AMV逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成第二條DNA鏈。T7RNA聚合酶識別雙鏈DNA中的啟動子區(qū),催化DNA轉(zhuǎn)錄為RNA,由每一分子模板可產(chǎn)生100拷貝的RNA。新合成的RNA進(jìn)人循環(huán)相,成為反轉(zhuǎn)錄的模板。他們首先與引物P2結(jié)合,由AMV逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成一條DNA鏈,形成RNA:DNA雜交分子,RNaseH水解RNA,留下一條單鏈DNA,引物P1退火,逆轉(zhuǎn)錄酶再催化合成一條新的含有T7RNA聚合酶啟動子的DNA片段,T7RNA聚合酶再以此DNA為模板合成更多拷貝的RNA,如此循環(huán)反復(fù),使RNA拷貝數(shù)被不斷放大。該技術(shù)尤其適合于單鏈RNA的擴(kuò)增。

2 NASBA擴(kuò)增反應(yīng)步驟

2.1 RNA的提取

NASBA方法中的RNA提取可以采用試劑盒或者常規(guī)RNA提取的方法,主要經(jīng)過T rizol裂解細(xì)胞,氯仿抽提,異丙醇沉淀,乙醇洗滌這幾個步驟,操作過程中的耗材均要經(jīng)過DEPC水的處理,防止RNA酶降解所提取的RNA。

2.2 RNA的NASBA法擴(kuò)增

將提取的RNA加到標(biāo)準(zhǔn)的NASBA反應(yīng)體系中,先在65℃水浴5 min以破壞RNA的二級結(jié)構(gòu),然后42℃條件下水浴5 min使引物與模板退火。5 min后迅速加入酶混合液開始擴(kuò)增反應(yīng),42℃水浴,孵育2 h后轉(zhuǎn)入-20℃終止反應(yīng)[5]。

3 NASBA擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

3.1 電化學(xué)發(fā)光檢測法

目前使用最多的定量檢測NASBA產(chǎn)物的方法為電化學(xué)發(fā)光檢測法(electrochemiluminescence,ECL)[6-9]。該方法需要兩個與NASBA產(chǎn)物互補(bǔ)的寡核苷酸探針,分別是捕獲探針和檢測探針。檢測探針標(biāo)記有電化學(xué)光信號,捕獲探針攜帶生物素。二者與NASBA產(chǎn)物在雜交液中產(chǎn)生雜交復(fù)合物。此過程中該復(fù)合物被磁珠捕獲到電極處,TAG也被吸附到電極表面,低電壓作用下釕離子發(fā)生氧化-還原反應(yīng)產(chǎn)生光子,經(jīng)過ECL閱讀器將光信號輸出可對RNA定量分析。這種檢測方法具有快速、敏感、不需要后期處理等優(yōu)點,如果在操作的過程當(dāng)中同時使用參照物,可以檢測到反應(yīng)初始的RNA數(shù)量。但是在使用的過程當(dāng)中需要ECL閱讀器等特殊儀器,不便于基層的使用。

3.2 熒光檢測法

分子信標(biāo)技術(shù)(NASBA-beacon)是將NASBA技術(shù)和實時分子燈塔技術(shù)相結(jié)合,具有更加方便、快捷、敏感、不易被污染等優(yōu)點。分子燈塔是具有“發(fā)夾”樣結(jié)構(gòu)的單鏈寡核苷酸探針,一般為含20～30個核苷酸,其中環(huán)狀序列是與目標(biāo)鏈互補(bǔ)的探針。當(dāng)無靶序列存在時,莖部的2條核苷酸鏈互補(bǔ),末端分別與熒光素(5′端)和淬火物質(zhì)(3′端)結(jié)合,莖部的雙鏈互補(bǔ)結(jié)構(gòu)使末端的熒光素和淬火物質(zhì)緊靠在一起,因熒光素共振能量轉(zhuǎn)移作用而使熒光被吸收,這樣熒光素就不能發(fā)光,此時便檢測不到熒光信號;當(dāng)有靶序列存在時,分子信標(biāo)的環(huán)序列與靶序列特異性結(jié)合,隨著環(huán)狀序列打開,莖部的雙鏈結(jié)構(gòu)也打開,熒光素共振能量轉(zhuǎn)移作用不能得到發(fā)揮,熒光素和淬火物質(zhì)分離使得此時能夠檢測到熒光。熒光檢測技術(shù)與NASBA技術(shù)都是在低溫條件下反應(yīng),所以這兩項技術(shù)可以完美的結(jié)合。該檢測方法操作簡單且省時,可以自動化操作,減少了攜帶污染,適合于分析高通量樣本[10-11]。

3.3 酶聯(lián)檢測法

3.3.1 酶聯(lián)凝膠試驗 酶聯(lián)凝膠試驗(enzymelinked gel assay,ELGA)即用5′端標(biāo)記了辣根過氧化物酶的寡核苷酸探針與NASBA產(chǎn)物作用,然后聚丙烯酰胺凝膠電泳將雜交復(fù)合物和未雜交的探針分離,過剩的未雜交探針便從雜交產(chǎn)物中析出,底物液孵育后顯色觀察。該方法通過探針上標(biāo)記物的的信號放大作用而檢測到目的片段,是一種快速、非放射性的方法[5]。

3.3.2 NASBA-酶聯(lián)寡核苷酸捕獲法 NASBA-酶聯(lián)寡核苷酸捕獲法(NASBA-enzyme-linked oligonucleotide capture,NASBA-EOC)即應(yīng)用 ELISA檢測系統(tǒng),生物素標(biāo)記的捕獲探針吸附于包被有鏈霉親和素的微孔板,而標(biāo)記地高辛的檢測探針與擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ),在雜交緩沖液進(jìn)行NASBA反應(yīng),然后加入酶聯(lián)抗地高辛抗體,經(jīng)顯色后在分光光度計中405 nm的波長下讀取吸光值檢測所產(chǎn)生的比色信號便可進(jìn)行結(jié)果判定[12-13]。

3.4 核酸雜交檢測法

核酸雜交檢測法(in situ hybridization-NASBA,IS-NASBA)是運用ISH雜交技術(shù),用經(jīng)過標(biāo)記的ISH探針與擴(kuò)增產(chǎn)物RNA雜交,洗脫掉沒有結(jié)合的ISH標(biāo)記探針,通過紫外分光光度計來檢測與RNA相結(jié)合的ISH標(biāo)記探針量,從而對擴(kuò)增產(chǎn)物RNA作定量分析。IS-NASBA技術(shù)比IS-PCR具有更高的敏感性和擴(kuò)增效率,操作簡單方便[14]。

4 NASBA反應(yīng)特點

4.1 特異性強(qiáng)

由于上游引物P1的5′端含有T7RNA聚合酶啟動子序列,外來雙鏈DNA便不可能被擴(kuò)增,這就顯著提高了NASBA反應(yīng)的特異性。另外,由于反應(yīng)不需高溫變性步驟,所以 NASBA不會受到雙鏈DNA的污染。

4.2 靈敏度高

較高的擴(kuò)增效率決定了該方法的高靈敏度,NASBA反應(yīng)2 h左右可將模板RNA擴(kuò)增約109～1012倍,合成的 RNA 量達(dá)1.3 μ g。一個 RNA 模板能夠產(chǎn)生大約100個拷貝。比起PCR技術(shù),該技術(shù)能用較少的循環(huán)便擴(kuò)增出大量的目的基因,保證了NASBA的高敏感性[7]。

4.3 保真度高

與PCR的產(chǎn)物DNA分子不同,NASBA法的產(chǎn)物RNA分子不易對實驗儀器和環(huán)境造成污染,避免了產(chǎn)物交叉污染引起的假陽性結(jié)果。而且由于NASBA的高效性縮短了反應(yīng)時間,從而降低了酶促反應(yīng)過程中的核苷酸錯配機(jī)率,因此轉(zhuǎn)錄更加忠實于模板。

4.4 操作簡便

NASBA具有擴(kuò)增效率高,特異性強(qiáng),高通量,需要的病料數(shù)量少等優(yōu)點,較易實現(xiàn)自動化。此外,該方法為等溫擴(kuò)增,使用的過程當(dāng)中不需要PCR儀等特殊的設(shè)備,只使用恒溫水浴鍋就可以完成整個擴(kuò)增反應(yīng)過程,更適合基層實驗室使用,可應(yīng)用于動物口岸和產(chǎn)地檢疫、養(yǎng)殖場環(huán)境監(jiān)測、畜禽群體健康狀況檢測和疾病診斷等[18]。

5 NASBA技術(shù)在畜禽病毒檢測中的應(yīng)用

目前,NASBA技術(shù)在國內(nèi)外已經(jīng)成功的應(yīng)用于多種病毒的檢測,但主要集中在人類疾病領(lǐng)域,如人的艾滋病病毒(HIV)[15-17]、甲型肝炎病毒(HAV)[19]、丙型肝炎病毒(HCV)[20]、狂犬病病毒(RV)[21]。在獸醫(yī)領(lǐng)域的研究,已有應(yīng)用于禽流感(AI),新城疫(ND),藍(lán)耳病(PRRS),傳染性胃腸炎(TGE),口蹄疫(FMD)等疾病的診斷和檢測研究的報道。與目前商品化的免疫檢測試劑盒相比,NASBA技術(shù)至少敏感1 000倍,比常規(guī)PCR方法也敏感許多,與現(xiàn)行的病毒培養(yǎng)檢測方法的靈敏度相當(dāng),因此,該方法已經(jīng)引起許多研究者的關(guān)注。

5.1 NASBA法檢測禽流感病毒

單松華等[22]對H5亞型禽流感病毒HA基因序列進(jìn)行分析,設(shè)計并篩選了最佳引物,采用優(yōu)化的NASBA方法對禽流感病毒進(jìn)行特異性和敏感性實驗。結(jié)果僅檢測到了禽流感病毒H5亞型,其他20個已知病毒樣品皆為陰性,表明該方法的特異性強(qiáng)。采用已知禽流感病毒A/Chicken/HK/1000/97(H5N1)的雞胚尿囊液(ELD5010-7.5/mL),經(jīng)10倍連續(xù)稀釋,用病原分離法和NASBA法進(jìn)行比較,二種方法的靈敏度相當(dāng)。用A/Chicken/HK/1000/97(H5N1)病毒人工感染SPF雞、商品雞,采用NASBA法和病原分離法同時對人工感染雞的糞拭子、血液進(jìn)行了動態(tài)檢測,共檢測了101個組織臟器,兩種方法的符合率為 90%(87/97),表明該方法敏感性高。

5.2 NASBA法檢測新城疫病毒

Cui S J等[23]針對新城疫病毒的融合蛋白基因(F基因)保守片段設(shè)計引物,應(yīng)用NASBA技術(shù)檢測了7個血清型的72份新城疫病毒,10-8稀釋度仍能檢測到病毒存在,比傳統(tǒng)的病毒培養(yǎng)敏感度高10倍。特異性較好,與人A型流感病毒和H5亞型禽流感病毒無交叉反應(yīng)。由于新城疫的傳染性強(qiáng),對雞群危害十分嚴(yán)重,早期診斷和雞場環(huán)境監(jiān)測顯得尤為重要。該方法有著檢測準(zhǔn)確,靈敏,操作簡便,檢測時間短等優(yōu)點,對于新城疫的快速診斷和檢測具有重要的意義。

5.3 NASBA法檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒

梁海霞等[5]針對豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF1中編碼非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp 2的基因序列設(shè)計引物,建立了核酸序列依賴性擴(kuò)增(NASBA)方法,并結(jié)合ELISA技術(shù)建立了NASBA-ELISA方法用來檢測高致病性 PRRSV。采用建立的 NASBAELISA可檢測到 101.83TCID50/mL的 Hu N4株P(guān)RRSV。結(jié)果表明,NASBA-ELISA能夠敏感并特異地檢測高致病性PRRSV,而對經(jīng)典株P(guān)RRSV和其他豬源病毒的檢測結(jié)果均為陰性,體現(xiàn)了該方法的高敏感性和高特異性。

5.4 NASBA法檢測豬傳染性胃腸炎病毒

李小蘭等[24]建立了豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)的 NASBA檢測方法,該研究利用豬TGEV的 S基因保守序列設(shè)計引物,建立了擴(kuò)增TGEV的NASBA檢測技術(shù)。對 TGEV進(jìn)行擴(kuò)增獲得約 200 bp特異性目的條帶,而對 CSFV、PRRSV、PCV-2、PPV、PEDV 和ST細(xì)胞擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。該研究利用病毒分離法、RT-PCR法和建立的NASBA方法對86份臨床樣品進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示NASBA最低病毒檢出量為5 pg,RT-PCR與NASBA的符合率為84.9%,病毒分離法與NASBA的符合率為98.8%,表明NASBA法的敏感性與病毒分離法相當(dāng),但病毒分離法操作費時,實驗條件要求高。NASBA的靈敏度高于普通 RTPCR,與病毒分離方法相當(dāng),可檢測到5 pg的核酸,而RT-PCR的檢出量為100 pg,為TGEV的早期診斷提供了新途徑。

5.5 NASBA法檢測豬口蹄疫病毒

Lau L T等[12]針對口蹄疫病毒(FMDV)基因組5′非轉(zhuǎn)譯區(qū)(5′UT R)高保守性 IRES序列設(shè)計通用引物,用NASBA法可以檢測到7個血清型的FMDV。對 200份 FMDV樣品,以 NASBA-ECL和NASBA-EOC方法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物,NASBA-ECL的敏感性為 92.9%,NASBA-EOC的敏感性為 97.1%,均高于常規(guī)的RT-PCR。高特異性和高敏感性以及相對簡單的操作性使得該方法對于口蹄疫的快速檢測具有很好的應(yīng)用前景。

6 展望

傳統(tǒng)的檢測方法已經(jīng)不能準(zhǔn)確的診斷病原,運用分子生物學(xué)手段檢測病原已經(jīng)成為一種趨勢。目前,應(yīng)用范圍最為廣泛的診斷方法為PCR,能夠較為準(zhǔn)確檢測畜禽病毒性疾病。而NASBA技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、反應(yīng)迅速、操作簡單等特點,特異性和靈敏性均高于 PCR,當(dāng)發(fā)生疫情時能夠及時、準(zhǔn)確地檢測病毒感染的情況,以及時采取有效措施控制疾病的蔓延。另外,利用該技術(shù)的高度靈敏性和特異性可以用于疾病流行情況和養(yǎng)殖環(huán)境監(jiān)測,防患于未然,降低不必要的恐慌和損失。該技術(shù)在獸醫(yī)領(lǐng)域具有良好的發(fā)展前景及廣闊的應(yīng)用前景。

[1]丁 鏟.病毒的進(jìn)化與傳播[J].中國動物傳染病學(xué)報,2010,18(4):71-75.

[2]Compton J.Nucleic acid sequence-based amplification[J].Nature,1991,350:91-92.

[3]馬保華,李 賀,呂 平,等.依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)在動物病原微生物檢測中的應(yīng)用[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2007,28(4):110-112.

[4]Souza D H,Jaykus L A.Nucleic acid sequence based amplification for the rapid and sensitive detection ofSalmonella entericafrom foods[J].App Microbiol,2003,95(6):1343-1350.

[5]梁海霞,薛青紅,高金源,等.高致病性豬生殖與呼吸綜合征病毒NASBA-ELISA檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2009,39(05):401-404.

[6]趙志權(quán),王福廣,郝環(huán)潁,等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的 RT-PCR鑒別診斷方法[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2008,29(3):68-78.

[7]高閃電,?；菔|,叢國正,等.NASBA(依賴核酸序列的擴(kuò)增)技術(shù)及其在病毒檢測中的應(yīng)用[J].中國生物工程雜志,2009,29(1):80-85.

[8]寇曉霞,吳清平,范宏英.輪狀病毒NASBA檢測研究[J].微生物學(xué)報,2006,46(2):328-330.

[9]Costa A,Lamb D,Garland S M,et al.Evaluation of light cycler as a platform for nucleic acid sequence-based amplification(NASBA)in real-time detection of enteroviruses[J].Curr Microbiol,2008,56:80-83.

[10]Weusten J J A M,Carpay W M,T om A M,et al.Principles of quantitation of viral loads using nucleic acid sequence-based amplification in combination with homogenous detection using molecular beacons[J].Nucleic Acid Res,2002,30,e26

[11]王 虹,陳金華,曾位森,等.NASBA熒光分子信標(biāo)技術(shù)定量檢測丙型肝炎病毒[J].中國生物工程雜志,2003,23(12):111-113.

[12]Lau L T,ScottM R,Donald P K .Detection of foot and mouth disease virus by nucleic acid sequence-based amplification(NASBA)[J].Vet Microbiol,2008,126(1-3):101-110.

[13]孔令青,李 勇,高 洪,等.生物素親和素標(biāo)記技術(shù)[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2008,29(4):100-102.

[14]秦維超.NASBA和 IS-NASBA的臨床應(yīng)用及研究進(jìn)展[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2006,27(2):158-160.

[15]Uyttendaele M,Sehukkink R,Gemen B,et al.Development of NASBA,a nucleic acid amplification system,or identification of Listeria monocytogenes and comparison to ELISA and a modified FDA method[J].Food Microbiol,1995,27(1):77-89.

[16]Samuelson A,Westmoreland D,Eccles R,et al.Development and application of a new method for amplification and detection of human rhinovirus RNA[J].Virol Methods,1998,71(2):197-209.

[17]馬義才,陳李容,Alison Cox.661份 HIV抗體陽性血漿標(biāo)本HIV-1 RNA濃度測定[J].中國輸血雜志,2003,16:312-313.

[18]Deiman B,Aarle P V,Sillekens P.Characteristics and applications of nucleic acid sequence-based amplification(NASBA)[J].Mol Biotechnol,2002,20(2):163-179.

[19]顏 進(jìn),劉劍雄,彭紅梅.NASBA(核酸序列依賴的擴(kuò)增)及其在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用[J].國外醫(yī)學(xué):臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊,1997,18:66-69.

[20]駱利敏,黃建生,李 明,等.應(yīng)用 NASBA定量檢測 HCV RNA的研究進(jìn)展[J].Tropical Medicine,2002,52(1):64-66.

[21]Wacharapluesadee S,Hemachudha T.Nucleic-acid sequencebased amplification in the rapid diagnosis of rabies[J].Lancet,2001,358(9285):892-893.

[22]單松華,劉樂庭,陳家華,等.NASBA快速檢測禽流感 H5亞型病毒[J].中國病毒學(xué),2005,20(3):288-292.

[23]Cui S J,Fung Y W,Lau L T,et al.Detection of newcastle disease virus using nucleic acid sequence-based amplification[J].Biologicals,2007,35(1):13-18.

[24]李小蘭,聶福平,李應(yīng)國,等.豬傳染性胃腸炎病毒NASBA檢測方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2010,32(6):451-454.

NASBA Technology and Its Application in Detection of Livestock Viruses

ZHANG Rong-sheng1,2,YAN Ming-hua1,ZHANG Guo-wei1,ZHANG Li1

(1.Tianjin Agricultural University,T ianj in,300384,China;2.Institute of Animal Science and Veterinary Medicine,Tianjin,300112)

Nucleic acid sequence based amplification(NASBA)is an isothermal amplification program which is mediated by a pair of special primerin vitro.The technology could be operated easily and fast.It has been widely applied in the detection of many viruses,that infect human and animals,depended on its high specificity and sensibility.Its high specificity and sensibility has been represented in the detection of avian influenza virus,newcastle disease virus,porcine transmissible gastroenteritis virus,food and mouth diease virus.The paper briefly introduced the principle,characteristics of NASBA and its application in the detection of livestock viruses in order to provide a new approach to the technology of viral detection.

NASBA;principle;viral detection

2010-12-17

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿研究計劃重點項目(08JCZDJC16800)

張榮升(1986-),男,山東臨沂人,碩士研究生,主要從事動物分子病原學(xué)研究。*通訊作者

Q789

B

1007-5038(2011)07-0101-04