荊元強(qiáng),宋恩亮,楊維仁,劉桂芬,譚秀文,萬(wàn)發(fā)春*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,山東泰安 271018;2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,山東濟(jì)南 250100;3.山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東濟(jì)南 250100)

牛瘤胃微生物定量測(cè)定方法研究進(jìn)展

荊元強(qiáng)1,2,3,宋恩亮2,3,楊維仁1,劉桂芬2,3,譚秀文2,3,萬(wàn)發(fā)春2,3*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,山東泰安 271018;2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,山東濟(jì)南 250100;3.山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東濟(jì)南 250100)

瘤胃微生物數(shù)量測(cè)定一直是反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)的難點(diǎn)之一。傳統(tǒng)的定量方法有亨氏滾管法和最大可能計(jì)數(shù)法(MPN)兩種,方法簡(jiǎn)單,但工作量大,測(cè)定結(jié)果與實(shí)際存在偏差?，F(xiàn)代分子定量技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展,為瘤胃微生物數(shù)量的測(cè)定提供了一種新的思路和方法。如核算分子雜交技術(shù)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)或溫度梯度凝膠電泳(TGGE)、定量PCR技術(shù)等。隨著現(xiàn)代分子定量技術(shù)的不斷發(fā)展和完善,人們對(duì)瘤胃微生物的定量研究必將更加深入。論文簡(jiǎn)要對(duì)瘤胃微生物數(shù)量測(cè)定方法進(jìn)行了綜述,旨在為開(kāi)展瘤胃微生物的研究提供參考。

瘤胃微生物;傳統(tǒng)定量;分子定量

反芻動(dòng)物的瘤胃是一個(gè)復(fù)雜而又獨(dú)特的微生態(tài)系統(tǒng),其內(nèi)棲息著多種多樣的微生物。這些微生物的存在使瘤胃成為反芻動(dòng)物消化吸收的最重要部位。因此,研究瘤胃微生物的種類(lèi)和數(shù)量變化有助于探索瘤胃在反芻動(dòng)物消化代謝體系中的作用機(jī)理,進(jìn)而達(dá)到調(diào)控瘤胃功能的目的[1]。長(zhǎng)期以來(lái)研究人員都采用傳統(tǒng)的定量方法來(lái)測(cè)定瘤胃微生物的種類(lèi)和數(shù)量變化。然而,瘤胃微生物生長(zhǎng)要求嚴(yán)格厭氧環(huán)境,這使得大部分細(xì)菌無(wú)法培養(yǎng)。因此,傳統(tǒng)的培養(yǎng)、直接觀(guān)察的定量方法不能準(zhǔn)確測(cè)定瘤胃微生物的數(shù)量[2]。近年來(lái),隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)突飛猛進(jìn)的發(fā)展,逐步建立了較為完善的分子定量方法用于測(cè)定瘤胃微生物種類(lèi)和數(shù)量變化。與傳統(tǒng)定量方法相比,現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)能夠準(zhǔn)確、快速、高效的定量測(cè)定瘤胃微生物,是瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)研究的必然趨勢(shì)[3]。

1 瘤胃微生物組成

瘤胃內(nèi)棲息著復(fù)雜、多樣、非致病性的微生物,包括細(xì)菌、真菌、原蟲(chóng)和古菌等,還有少數(shù)噬菌體[4-5]。在瘤胃微生物中,細(xì)菌的數(shù)量巨大,種類(lèi)最多,其種類(lèi)和數(shù)量受飼料性質(zhì)、采食后的時(shí)間、宿主生理狀態(tài)等多種因素的影響。通常情況下瘤胃內(nèi)容物中的細(xì)菌數(shù)量為1010～1011cfu/mL。目前,人們已經(jīng)從瘤胃中分離出29個(gè)屬的200多種細(xì)菌,其中絕大多數(shù)為厭氧菌和兼性厭氧菌,最主要的有纖維降解菌、淀粉降解菌、瘤胃產(chǎn)甲烷菌等[6]。瘤胃內(nèi)的細(xì)菌對(duì)于降解飼料有效成分有非常重要的作用。細(xì)菌之間以及細(xì)菌與其他微生物之間的相互作用有助于揮發(fā)性脂肪酸和微生物蛋白的合成[7]。

瘤胃原蟲(chóng)是瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)中重要的一部分,按其形態(tài)可以分為瘤胃鞭毛蟲(chóng)和瘤胃纖毛蟲(chóng)兩大類(lèi),以纖毛蟲(chóng)為主。在瘤胃內(nèi)原蟲(chóng)數(shù)量比細(xì)菌少的多,一般為105～106cfu/mL,但原蟲(chóng)個(gè)體較大,在生物量上并不比細(xì)菌少[8]。瘤胃纖毛蟲(chóng)不但可將植物纖維和淀粉轉(zhuǎn)變成揮發(fā)性脂肪酸,還可吞食一定量的瘤胃細(xì)菌,從而降低瘤胃細(xì)菌消化淀粉的速率,維持瘤胃內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定。瘤胃纖毛蟲(chóng)的繁殖速度非?？臁?/p>

瘤胃中的真菌數(shù)量不多,但種類(lèi)較多,迄今為止,從瘤胃中分離到的厭氧真菌多達(dá)6個(gè)屬16種。瘤胃真菌相對(duì)是嚴(yán)格厭氧的,正常瘤胃內(nèi)容物中厭氧真菌的游動(dòng)孢子數(shù)為103～105cfu/mL[9]。依據(jù)菌絲的形成方式瘤胃真菌可分為單中心和多中心兩種類(lèi)型,其中,單中心類(lèi)型真菌的菌絲體形成單個(gè)孢子囊,而多中心類(lèi)型真菌的菌絲體則可形成多個(gè)孢子囊,這些孢子囊均可釋放出游動(dòng)的孢子。孢子可附著在飼料上生長(zhǎng),逐漸形成新的菌絲體[10]。由于瘤胃真菌是瘤胃中分泌纖維素酶的主要微生物,因此成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。

2 瘤胃微生物的傳統(tǒng)定量方法

由于瘤胃內(nèi)微生物的種類(lèi)繁多,很多在體外根本無(wú)法培養(yǎng)。因此,從20世紀(jì)50年代開(kāi)始研究人員就一直在尋求測(cè)定瘤胃微生物數(shù)量和種類(lèi)變化的技術(shù),并建立了一系列不同的方法,其中最為經(jīng)典的是亨氏滾管法和最大可能計(jì)數(shù)法。

2.1 亨氏滾管法

亨氏滾管法因最早是由Hungate R E于1969提出而得名[11]。其基本步驟為:在亨氏管中的培養(yǎng)基上接種,流水冷卻。將凝固后的培養(yǎng)基放入39℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)數(shù)天后,挑取滾管壁上出現(xiàn)的單菌落放入新鮮的培養(yǎng)基培養(yǎng)。新培養(yǎng)的菌液經(jīng)過(guò)多次滾管和單菌落分離后即可得到純的菌株。通過(guò)滾管后菌落的多少可對(duì)瘤胃細(xì)菌和真菌培養(yǎng)菌計(jì)數(shù),也可用于瘤胃液中細(xì)菌和真菌的活菌計(jì)數(shù)。但這種方法存在著很大的局限性。因?yàn)榇蠖鄶?shù)瘤胃微生物都是厭氧的,而保持絕對(duì)厭氧環(huán)境存在很大的難度,而且很多瘤胃微生物在體外無(wú)法培養(yǎng)[12]。

2.2 最大可能計(jì)數(shù)法

除亨氏滾管法可用于計(jì)數(shù)活菌外,目前最常用的傳統(tǒng)定量方法是MPN。其基本要點(diǎn)是先梯度稀釋接種物,然后每個(gè)稀釋度經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后通過(guò)直接觀(guān)察微生物的生長(zhǎng)情況,或?qū)ε囵B(yǎng)液進(jìn)行pH檢測(cè)確定每管是否有微生物生長(zhǎng),最后根據(jù)MPN表?yè)Q算確定微生物的濃度。Dehority B A等[13]發(fā)表了用于瘤胃細(xì)菌的MPN計(jì)數(shù)法,并發(fā)現(xiàn)此法與滾管法的總細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果相一致。

3 瘤胃微生物的現(xiàn)代分子技術(shù)定量方法

由于瘤胃微生物培養(yǎng)的條件高、難度大,再加上傳統(tǒng)的計(jì)數(shù)方法工作量大、耗時(shí)長(zhǎng),對(duì)一些不可培養(yǎng)的微生物又無(wú)法計(jì)數(shù)等,導(dǎo)致瘤胃微生物的定量研究一直進(jìn)展緩慢。而現(xiàn)代分子生物技術(shù)的興起和發(fā)展,使建立快速、科學(xué)、靈敏的瘤胃微生物定量方法成為可能[14]。

3.1 核酸分子雜交技術(shù)

該技術(shù)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的,其原理是基于核酸分子具有互補(bǔ)配對(duì)的特性,用特異性探針和待測(cè)樣品核酸雜交,然后檢測(cè)。特異性探針常用16 S rDNA/rRNA分子的保守序列來(lái)設(shè)計(jì)。這種方法最大的優(yōu)點(diǎn)是可以檢測(cè)一些尚不能成功培養(yǎng)的瘤胃微生物[15]。

3.1.1 斑點(diǎn)雜交技術(shù)和狹線(xiàn)雜交技術(shù) 斑點(diǎn)雜交技

術(shù)(dot hybridization technique,DHT)和狹線(xiàn)雜交技術(shù)

(technique,SHT)是現(xiàn)代分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。其方法是通過(guò)用特異的探針與樣品雜交,估計(jì)樣品點(diǎn)發(fā)射出的信號(hào)強(qiáng)度,與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行比較,確定待測(cè)樣品中靶序列的量;也可利用通過(guò)探針和特異探針在相同條件下分別對(duì)同一樣品進(jìn)行雜交后的相應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度比來(lái)計(jì)算特異探針?biāo)鶎?duì)應(yīng)的RNA占通用探針?biāo)鶎?duì)應(yīng)的靶RNA的百分含量[16]。但是,即使是同一張雜交膜上同一樣品的雜交信號(hào)有時(shí)也不穩(wěn)定,結(jié)果重現(xiàn)性差,在定量研究中的應(yīng)用效果不夠理想。因此,這種技術(shù)在瘤胃微生物的定量方面未得到廣泛應(yīng)用[10]。

3.1.2 熒光原位雜交 熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)是采用特異的熒光標(biāo)記探針在未破碎的細(xì)胞內(nèi)與它的互補(bǔ)序列完整結(jié)合,通過(guò)熒光信號(hào)檢測(cè)核酸序列。FISH結(jié)合圖形分析能快速計(jì)數(shù)微生物數(shù)量,同時(shí)還可以對(duì)不同類(lèi)群的微生物在細(xì)胞水平上進(jìn)行原位的定量分析。

Mackie R I等[17]采用FISH技術(shù)測(cè)定了不同反芻動(dòng)物中顫螺菌的含量。Soliva C R等[18]用總甲烷菌和四個(gè)種類(lèi)甲烷菌(甲烷桿菌、甲烷球菌、甲烷微菌和甲烷八疊球菌)的特異性探針研究了肉豆蔻酸對(duì)甲烷生成和甲烷菌數(shù)量的影響。這些研究充分說(shuō)明FISH技術(shù)可用于定量瘤胃微生物。但是,該技術(shù)容易受到樣品微生物生理狀態(tài)的影響,所以在檢測(cè)中會(huì)存在一定的偏差[19]。

3.2 變性梯度凝膠電泳或溫度梯度凝膠電泳

DGGE或TGGE都屬于DNA指紋技術(shù)。DGGE技術(shù)發(fā)展最為迅速,其原理是通過(guò)不同的變性劑梯度,顯示不同DNA的差異片段。DGGE的方法是將PCR擴(kuò)增得到的等長(zhǎng)的DNA片段加入到含有變性劑梯度的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳,由于DNA片段空間構(gòu)型的變化會(huì)改變電泳速度,因此,會(huì)在不同變性劑梯度凝膠位置上呈現(xiàn)各自的條帶。停留在相同位置的條帶,可視為具有相同的 DNA序列[20]。DGGE或TGGE技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于微生物的定量和多樣性的研究。但是,該技術(shù)對(duì)于瘤胃中含量很少的微生物,當(dāng)其DNA在DNA總量中不足1%時(shí)就很難檢測(cè)到[21]。因此,在微量瘤胃微量微生物的定量中不理想,有待于進(jìn)一步提高和完善。

3.3 定量PCR技術(shù)

PCR技術(shù)是由美國(guó)科學(xué)家Muliis K于1985年發(fā)明的一種可在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的分子生物學(xué)技術(shù)[22]。定量PCR技術(shù)是對(duì)普通PCR技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和補(bǔ)充。其中,競(jìng)爭(zhēng)PCR技術(shù)和熒光實(shí)時(shí)定量PCR因其定量準(zhǔn)確、迅速等優(yōu)勢(shì)而開(kāi)始被廣泛應(yīng)用于微生物定量研究中,在瘤胃微生物的定量研究中也顯示出了很好的應(yīng)用。

3.3.1 競(jìng)爭(zhēng)PCR技術(shù) 當(dāng)瘤胃液細(xì)菌數(shù)低于總菌數(shù)的0.01%時(shí),核酸分子雜交法雖然不能準(zhǔn)確測(cè)定,但其

rRNA定量方法卻極大地推動(dòng)了目標(biāo)rDNA定量方法的發(fā)展,如競(jìng)爭(zhēng)PCR技術(shù)。該技術(shù)能夠排除管間及樣本間的變化誤差,可用于核酸的絕對(duì)定量和低拷貝基因的定量測(cè)定。這種技術(shù)在瘤胃微生物的定量研究中已被廣泛應(yīng)用[14]。競(jìng)爭(zhēng)PCR技術(shù)雖然定量相對(duì)準(zhǔn)確,

但耗時(shí)較長(zhǎng),對(duì)于大量樣品進(jìn)行定量研究時(shí)存在一定的難度。Sekhavati M H等(2009)首次建立了針對(duì)瘤胃厭氧真菌的競(jìng)爭(zhēng)定量PCR方法,通過(guò)與基于幾丁質(zhì)測(cè)定的真菌定量方法相比較,驗(yàn)證了該方法在體外條件下的有效性[23]。

3.3.2 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 實(shí)時(shí)定量PCR(real-time

quantitative PCR,RT-PCR)技術(shù)也是在普通PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種高靈敏的核酸定量技術(shù)。這種技術(shù)是在PCR的反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記物質(zhì),當(dāng)熒光標(biāo)記物與新合成的雙鏈DNA嵌合后,就可根據(jù)熒光信號(hào)的累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較產(chǎn)物積累的速度(時(shí)間)來(lái)間接對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。RT-PCR技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了從定性到定量的飛躍,而且在保持傳統(tǒng)PCR靈敏、快速等特點(diǎn)的基礎(chǔ)上,具有特異性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確、重復(fù)性好、不存在 PCR過(guò)程后處理的污染問(wèn)題等眾多優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到瘤胃微生物的定量分析上。Bu D P等[24]首次采用RT-PCR方法研究了日糧中添加胡麻油和豆油對(duì)奶牛瘤胃產(chǎn)琥珀絲桿菌、瘤胃黃華球菌和瘤胃白色球菌數(shù)量變化。

目前,RT-PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用在甲烷菌的檢測(cè)中[25]。Hook S E等[26]利用RT-PCR技術(shù)分析了在采食相同日糧條件下泌乳奶牛瘤胃甲烷菌數(shù)量的變化,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加莫能菌素的六個(gè)月內(nèi)甲烷菌數(shù)量無(wú)顯著變化。Guo Y Q等[27]利用RT-PCR方法檢測(cè)了甲烷生成被抑制時(shí)瘤胃甲烷菌數(shù)量的變化,發(fā)現(xiàn)甲烷排放和甲烷菌數(shù)量的變化并不一致。

4 展望

瘤胃是生物界中最復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)之一,在反芻動(dòng)物的消化過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色。由于傳統(tǒng)方法不能夠準(zhǔn)確測(cè)定瘤胃微生物數(shù)量,限制了對(duì)它的深入研究。近年來(lái)隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,使分類(lèi)瘤胃微生物及準(zhǔn)確定量數(shù)量成為可能,研究人員對(duì)瘤胃微生物的研究也進(jìn)一步深入。今后,隨著傳統(tǒng)定量技術(shù)和現(xiàn)代分子定量技術(shù)的結(jié)合和進(jìn)一步發(fā)展,必將會(huì)大大提高瘤胃微生物數(shù)量測(cè)定的準(zhǔn)確度,拓展瘤胃微生物功能研究的深度和廣度。

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Progress on Quantification Methods of Bovine Rumen Microbes

JING Yuan-qiang1,2,3,SONG En-liang2,3,YANG Wei-ren1,LIU Gui-fen2,3,TAN Xiu-wen2,3,W AN Fa-chun2,3

(1.College of Animal Science and Technology,Shandong Agricultural University,Taian,Shandong,271018,China;2.Institute of Animal Science and Veterinary Medicine,Shandong Academy of Agricultural Sciences,J inan,Shandong,250100,China;3.Shandong Key Laboratory of Animal Disease Control and Breeding,J inan,Shandong,250100,China)

The quantification of rumen microorganisms has been one of the difficulties of ruminant nutrition.The traditional methods comprise the classical roll-tube technique and maximum possible count technique.The appearance and development of molecular quantitative methods have provided a new idea and methods for quantifying rumen microorganisms.Such as:accounting hybridization,DGGE or TGFE,real-time PCR.With the constantly developing and improving,molecular quantitative methods will be in-depth to further study.The author reviewed the quantification methods of rumen microbes briefly for providing a reference for the research of rumen microorganisms.

rumen microbe;traditional quantification;molecular quantification

S854.47

A

1007-5038(2011)07-0093-04

2010-12-27

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(肉牛)、公益性行業(yè)農(nóng)業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)課題(nyhyzx07-036-01-01,nyhyzx07-036-05,20090300608);省應(yīng)用創(chuàng)新項(xiàng)目“優(yōu)質(zhì)高檔肉牛生產(chǎn)技術(shù)研究”

荊元強(qiáng)(1984-),男,山東平度人,碩士研究生,主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)研究。*通訊作者