唐 娜,王金良,曲光剛,沈志強(qiáng),2*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東濱州 256600;2.山東綠都生物科技有限公司,山東濱州 256600)

鄰位連接技術(shù)及其在病原檢測中的應(yīng)用*

唐 娜1,王金良1,曲光剛1,沈志強(qiáng)1,2*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東濱州 256600;2.山東綠都生物科技有限公司,山東濱州 256600)

鄰位連接技術(shù)(proximity ligation assay,PLA)是近年新研發(fā)的一種蛋白質(zhì)體外分析技術(shù),該技術(shù)運(yùn)用鄰位連接與實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增原理,通過一對可特異性識別靶蛋白的鄰位探針進(jìn)行雙識別并連接產(chǎn)生可PCR擴(kuò)增的檢測信號,實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的定量檢測。該技術(shù)綜合了抗原抗體結(jié)合的高特異性和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)的高靈敏度等多方面優(yōu)勢,已經(jīng)迅速應(yīng)用到生物標(biāo)記因子檢測、蛋白質(zhì)功能研究等領(lǐng)域,在疾病病原學(xué)診斷方面也取得了初步的進(jìn)展。論文綜述了鄰位連接技術(shù)的原理,并介紹了其在疫病病原學(xué)診斷領(lǐng)域的研究進(jìn)展。

鄰位連接技術(shù);蛋白質(zhì)分析;疾病診斷;病原學(xué)檢測

由病原微生物引起的傳染性疾病嚴(yán)重地影響著人類的健康和畜牧業(yè)的發(fā)展。為能迅速有效地發(fā)現(xiàn)與控制傳染病,學(xué)者們一直在努力探索靈敏、準(zhǔn)確、高效的病原檢測方法。目前常用的動(dòng)物疾病標(biāo)準(zhǔn)診斷方法有病原鑒定、凝集試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)(hemagglutination-inhibition test,HI)、間接熒光抗體試驗(yàn)(indirect fluorescent antibody test,IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)(Immunoperoxidase monolayer assay,IPMA),以及聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)等[1]。但隨著人們對早期診斷的要求日益增高,現(xiàn)有診斷方法的局限性日漸凸顯。病原鑒定等方法耗時(shí)長,不利于盡早診斷;HI、ELISA等方法較簡單,但檢測靈敏度較低,可能出現(xiàn)假陰性;PCR技術(shù)的應(yīng)用使病原檢測方法研究取得一個(gè)飛躍性進(jìn)展,但病原核酸檢測并不能完全替代病原蛋白質(zhì)的檢測:病原感染時(shí)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)抗原的種類和數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于病原核酸,某些病原蛋白質(zhì)只特異性地出現(xiàn)在疾病感染的特定階段;病原蛋白的活性關(guān)系著病原活性,病原核酸的檢測結(jié)果并不能完全代表其實(shí)際效價(jià);某些病原存在變異以及檢測樣品的成分復(fù)雜等,這些實(shí)際問題使得PCR等核酸檢測方法的應(yīng)用具有一定局限性[2]。因此,發(fā)展新的蛋白質(zhì)檢測方法,提高檢測靈敏度,簡化檢測步驟,縮短檢測時(shí)間,在動(dòng)物疾病診斷、感染機(jī)制研究以及疾病防控等領(lǐng)域?qū)a(chǎn)生重要意義。

自2002年首次報(bào)道以來,PLA技術(shù)在國外發(fā)展迅速,已經(jīng)大量用于細(xì)胞因子的檢測[3]、生物標(biāo)記蛋白功能狀態(tài)的觀察[4-5],以及疾病的病理生理過程研究等人類醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域[6-7]。本文對PLA技術(shù)的原理及其在病原診斷領(lǐng)域的初步應(yīng)用進(jìn)行了綜述,以期為該技術(shù)在疾病診斷領(lǐng)域的應(yīng)用研究提供依據(jù)。

1 鄰位連接技術(shù)

PLA技術(shù)最早由Fredriksson S等[8]2002年首次報(bào)道提出。該技術(shù)以一種稱為掛鎖探針(padlock probe)的DNA連接技術(shù)為基礎(chǔ)[9],對探針進(jìn)行了一定的改造,將一對探針的寡核苷酸單鏈分別與蛋白識別因子相連接,使其可以同步結(jié)合到一個(gè)待測蛋白分子上,這樣的一對探針被稱為“鄰位探針”。當(dāng)2條鄰位探針雙雙與相應(yīng)靶位點(diǎn)結(jié)合后,在連接酶作用下,蛋白上距離適宜的一對鄰位探針其寡核苷酸尾部的游離5′端和3′端可以發(fā)生鄰位連接反應(yīng),將探針與蛋白連接形成一個(gè)環(huán)狀的蛋白質(zhì)-蛋白識別分子-單鏈DNA復(fù)合物。通過實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增復(fù)合物中的單鏈DNA部分,可以靈敏地反映目的蛋白的存在,并在一定范圍內(nèi)對目的蛋白進(jìn)行定量分析。而且,只有在一對探針均與目的蛋白結(jié)合,且相互間距離足夠貼近時(shí),鄰位連接反應(yīng)才能夠發(fā)生,這使得PLA技術(shù)與PCR或其他檢測方法相比,具有更高的特異性和檢測靈敏度。

鄰位探針是PLA技術(shù)的關(guān)鍵。鄰位探針是由一對寡核苷酸單鏈和一種或一對蛋白識別因子連接而成。這對寡核苷酸單鏈必須是線性結(jié)構(gòu),游離端具備可發(fā)生連接反應(yīng)的基團(tuán),且寡核苷酸鏈的長度與所檢測蛋白質(zhì)的大小及識別位點(diǎn)間的距離有關(guān),根據(jù)寡核苷酸單鏈連接后的序列設(shè)計(jì)上下游引物、連接序列和實(shí)時(shí)定量PCR探針,要求上下游引物分別識別兩條寡核苷酸單鏈,而連接序列必須準(zhǔn)確涵蓋兩條寡核苷酸單鏈游離末端的數(shù)個(gè)至十幾個(gè)堿基[8]。

鄰位探針的蛋白識別因子的性質(zhì)與種類決定了PLA檢測的特異性與靈敏度。蛋白識別因子既可以是核酸[8],也可以是抗體等蛋白質(zhì)[10]。最早報(bào)道的鄰位探針其蛋白結(jié)合部分是一類經(jīng)由指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)[11](systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)從隨機(jī)核酸庫中選擇產(chǎn)生單鏈DNA“配基”(aptamer)。這類DNA“配基”可以特異地識別蛋白質(zhì)上的某一位點(diǎn)。運(yùn)用最多的識別因子是單克隆抗體或者多克隆抗體,因?yàn)榭贵w與靶蛋白的親和力強(qiáng),特異性高,較易制備。但制備探針必須將抗體與寡核苷酸單鏈進(jìn)行人工連接,常用的連接方法有化學(xué)交聯(lián)法和生物素-鏈親和素法等。應(yīng)用鏈親和素-生物素法時(shí),只需改變抗體種類便可以用于檢測多種蛋白質(zhì)分子,其適用范圍廣泛[12]。Darmanis S等[13]提出了生物素-鏈親和素-生物素法,可以有效地增加連接效率,提高寡核苷酸單鏈結(jié)合比例,從而提高了檢測靈敏度。此外,也可以根據(jù)所分析蛋白的特性,將抗體探針與DNA探針綜合使用[14]。

通常采用實(shí)時(shí)定量PCR方法進(jìn)行鄰位連接后的放大檢測。實(shí)時(shí)定量PCR方法具有非常高的靈敏度,并有定量檢測功能[15],目前已經(jīng)大量應(yīng)用到PLA技術(shù)檢測細(xì)胞生物標(biāo)記因子等研究中。近來人們又將滾環(huán)擴(kuò)增(rollingcircle amplification,RCA)技術(shù)應(yīng)用到了PLA的放大檢測中,建立了一種可對相互作用的蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞或組織內(nèi)定位的PLA方法,即原位PLA[16-17](in situ proximity ligation assay)。鄰位探針與待測的2個(gè)具有相互作用的蛋白質(zhì)分子分別結(jié)合,這2個(gè)蛋白質(zhì)分子因?yàn)橄嗷プ饔枚徑鼤r(shí),可發(fā)生鄰位連接反應(yīng)形成環(huán)狀DNA,以此環(huán)狀DNA為模板進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增則可得到含有大量重復(fù)DNA序列的DNA單鏈。在鄰位探針的DNA序列中加入有熒光標(biāo)記,則可以直接觀測到蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的定位,從而開展蛋白質(zhì)功能研究。

2 鄰位連接技術(shù)在病原檢測中的應(yīng)用

PLA技術(shù)以鄰位連接反應(yīng)為基礎(chǔ),結(jié)合了抗原抗體反應(yīng)的高特異性和實(shí)時(shí)定量PCR的高靈敏度,可以直接分析復(fù)雜生物樣品中的微量蛋白質(zhì),其檢測靈敏度與PCR方法近似甚至更高,可以檢測zeptomole級(10-21)的細(xì)胞因子[12]。PLA檢測所需樣品量少(僅1 μ L即可獲得較好結(jié)果),檢測時(shí)間短(僅需幾個(gè)小時(shí),與PCR相近),可直接檢測各種未經(jīng)處理的復(fù)雜生物樣品。因此,該技術(shù)自首次報(bào)道后發(fā)展迅速,現(xiàn)已經(jīng)廣泛應(yīng)用到蛋白質(zhì)定量分析,蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究,蛋白質(zhì)-核酸相互作用研究等多方面研究中,并初步形成了商品化檢測試劑盒[2]。

但是,盡管PLA技術(shù)已經(jīng)逐漸獲得人類醫(yī)學(xué)研究學(xué)者的廣泛關(guān)注,其在病原診斷領(lǐng)域的應(yīng)用仍處于起步階段,目前僅有數(shù)篇關(guān)于病毒和細(xì)菌檢測的報(bào)道。2005年P(guān)ai S等[18]最早根據(jù)細(xì)菌芽孢表面蛋白性質(zhì),合成多價(jià)短肽-DNA-藻紅蛋白復(fù)合物作為PLA探針“burr”,通過實(shí)時(shí)PCR檢測細(xì)菌芽胞,可以精確檢測到100個(gè)炭疽桿菌、10個(gè)枯草芽胞桿菌、1個(gè)蠟樣芽胞桿菌的芽胞。Gustafsdottir S M等2006年[19]建立PLA方法檢測胞內(nèi)勞森菌(Lawsonia intracellularis)和豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus),與相應(yīng)的ELISA法和定量PCR法的比較證明,PLA法的檢測靈敏度能比常規(guī)ELISA檢測方法提高3～4個(gè)數(shù)量級,且樣品需要量少,是ELISA法的千分之一。2007年Nordengrahn A等[20]應(yīng)用抗O型口蹄疫病毒單克隆抗體合成鄰位探針,建立了口蹄疫病毒(FMDV)野毒感染的診斷方法。該P(yáng)LA方法可以檢測到5個(gè)TCID50的病毒,檢測病毒的靈敏度與實(shí)時(shí)定量 RT-PCR相近,是抗原捕獲ELISA方法的100余倍。Schlingemann J等[21]將一株特異性針對禽流感病毒核蛋白的單抗生物素化,與商品化的鏈親和素-寡核苷酸鏈進(jìn)行連接合成鄰位探針,所建立的禽流感PLA可以特異性地直接檢測滅活的禽流感病毒各種血清型,且對同源性較高的傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒無明顯交叉反應(yīng);PLA法的檢測靈敏度與LUXTM實(shí)時(shí)定量PCR方法相近,但比ELISA方法高出3個(gè)～4個(gè)數(shù)量級,有望替代ELISA方法用作禽流感早期診斷的高通量篩選或補(bǔ)充辦法。

在PLA方法的研究方面,引入了固相PLA方法,可以進(jìn)一步降低檢測限[4,19]。將抗體固定于PCR微孔板壁,加入待測病原或抗原蛋白孵育,通過洗滌去除樣品中的未結(jié)合分子;加入鄰位探針及連接試劑連接后,再洗滌去除剩余的游離探針,最后通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測。低濃度特異性抗體的加入和去除了游離PLA探針,可以大大降低檢測的非特異性,使得固相PLA方法可以極其靈敏地分析復(fù)雜組分樣品中的痕量微生物病原,其特異性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于定量PCR,有時(shí)甚至高于液相PLA。

目前國際市場上已經(jīng)出現(xiàn)用于生物標(biāo)記蛋白質(zhì)分析的PLA試劑盒,但商品化病原檢測PLA試劑盒的實(shí)現(xiàn)還需要進(jìn)行大量的研究。

3 展望

PLA技術(shù)在病原檢測領(lǐng)域的應(yīng)用雖然很少,但已經(jīng)初步展現(xiàn)出該技術(shù)的巨大優(yōu)勢,PLA具有極高的特異性,具有與常用實(shí)時(shí)定量PCR相近、高出ELISA(使用同一抗體建立的)3個(gè)～4個(gè)數(shù)量級的靈敏度;避免了核酸提取操作,極大程度上極高了高通量檢測的可能性;可以檢測滅活樣本,保證了樣品轉(zhuǎn)移或運(yùn)輸過程中的安全性;基于實(shí)時(shí)定量PCR的PLA技術(shù),具有定量檢測功能,可以替代動(dòng)物試驗(yàn),用于病原蛋白質(zhì)的定量分析,等等。這些優(yōu)勢符合診斷技術(shù)發(fā)展的需要,PLA技術(shù)必將成為未來診斷技術(shù)研究的熱點(diǎn)。

但是應(yīng)該看到,現(xiàn)有的PLA技術(shù)仍然處于實(shí)驗(yàn)室研究階段,離推廣使用仍有相當(dāng)大的距離。未來的研究應(yīng)該集中于易化操作、降低成本、實(shí)現(xiàn)高通量檢測、檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化等方向,將這一高靈敏技術(shù)應(yīng)用于疾病早期診斷等領(lǐng)域,大大提高蛋白質(zhì)檢測水平,提高疾病診斷準(zhǔn)確率,推動(dòng)疾病感染與致病機(jī)制研究出現(xiàn)新進(jìn)展。

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Proximity Ligation Assay and Its Application in Pathogen Detection

TANG Na1,W ANG Jin-liang1,QU Guang-gang1,SHEN Zhi-qiang1,2

(1.Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Binzhou Animal Husbandry and Veterinary Research Institute in Shandong,Binzhou,Shandong,256600,China;2.LvduBiological Technology Co.,Ltd,Binzhou,Shandong,256600,China)

Proximity ligation assay(PLA)is a recently developed strategy for protein analysis in which a pair of proximity probes are designed to bind target proteins via a DNA ligation reaction of oligonucleotides resulting in the formation of an amplifiable DNA strand suitable for real-time PCR.Because of the extremely sensitive and specific detection of proteins,PLA has been wildly used in biomarkers identification,protein functional study,and primary application on the diagnosis of diseases.Here we discussed the basic principle and the potential applications of PLA in pathogen detection.

proximity ligation assay;protein analysis;disease diagnosis;pathogen detection

Q789

A

1007-5038(2011)07-0077-03

2010-12-08

唐 娜(1982-),女,江蘇連云港人,助理研究員,碩士,主要從事動(dòng)物疫苗與診斷試劑研究。*通訊作者