李鴻梅 王敬春 齊占朋 王 睿 李雪巖 劉吉成

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

白血病的治療一直以化療為主,大多數(shù)化療藥物都通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)達(dá)到消滅腫瘤細(xì)胞的目的,但是化療藥物在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的同時(shí)對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞的毒性作用也不容忽視。此外,腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥,也使化療的療效大大降低,甚至導(dǎo)致化療失敗。因此,從天然藥物中尋找既可提高治療效果又能減少對(duì)機(jī)體副作用的抗腫瘤活性成分,是當(dāng)今抗腫瘤藥物發(fā)展的主要方向之一。齊墩果酸(oleanolic acid,OA)是一種天然來(lái)源的藥物,廣泛存在于植物中,以游離或結(jié)合成苷的形式存在。近年來(lái),人們發(fā)現(xiàn) OA可以通過(guò)多種機(jī)制抑制肝癌、結(jié)腸癌、肺癌和順鉑耐藥胃癌細(xì)胞增殖〔1～5〕,但是 OA對(duì)體外培養(yǎng)的人早幼粒白血病(M3型)NB4細(xì)胞的作用未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以 M3型白血病 NB4細(xì)胞為研究對(duì)象,以不同劑量的OA處理,觀察其對(duì)細(xì)胞增殖的影響及其對(duì)凋亡相關(guān)基因Bcl-2及 Bax基因表達(dá)的影響,以探討OA抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 M3型白血病細(xì)胞株 NB4(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù));OA(中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)檢定所)。OA用二甲基亞砜(DMSO)溶解配制成 80 mmol/L的原液,-20℃儲(chǔ)存;用含10%小牛血清 RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的工作液。RPMI-1640和小牛血清(Gibco);SYBR ExScriptTMRT-PCR kit(Perfect Real Time,TaKaRa公司)。

1.2 NB4細(xì)胞的培養(yǎng) 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在 RPMI-1640培養(yǎng)基中,用滅菌的 5.6%NaHCO3溶液將培養(yǎng)基的 pH調(diào)至 7.2,每100ml培養(yǎng)基含青霉素 1萬(wàn) U,鏈霉素 10mg、小牛血清 10 ml。細(xì)胞置于 CO2孵箱,37℃、5%CO2、95%濕度條件下培養(yǎng)。為避免由于細(xì)胞密度過(guò)大而給細(xì)胞生長(zhǎng)和生存帶來(lái)的可能的影響,每天通過(guò)增加新鮮的培養(yǎng)基來(lái)調(diào)整細(xì)胞密度,使細(xì)胞密度不超過(guò) 5×105個(gè)/ml。

1.3 OA對(duì)NB4細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 NB4細(xì)胞,將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至 15 ml的離心管中,1 000 r/min離心 10 min,用新鮮的含 10%小牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為 5×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液后,將細(xì)胞接種于 3塊 96孔培養(yǎng)板。每孔加細(xì)胞懸液 200μl(1×104個(gè)細(xì)胞),然后加入OA,使其終濃度分別為 40、60、80和 100μmol/L,每毫升細(xì)胞培養(yǎng)液中 DMSO不超過(guò) 50μl。每個(gè)濃度均設(shè) 3個(gè)平行孔,調(diào)零孔不加 NB 4細(xì)胞懸液,只加含 10%小牛血清的 RPMI-1640。細(xì)胞分別培養(yǎng) 24、48和 72 h。實(shí)驗(yàn)終止前 4 h每孔加入 5 mg/ml的 MTT磷酸鹽緩沖液 20μl,同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,終止培養(yǎng)。1 000 r/min離心 10 min,棄上清。每孔再加入 DMSO 200μl,振蕩 10min后,用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng) 570 nm處測(cè)定吸光度值。按下面公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(IR,%)=(1-實(shí)驗(yàn)孔OD570/對(duì)照孔 OD570)×100%。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè) NB4細(xì)胞 Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)

100μmol/L OA處理細(xì)胞 72 h后,用 RNAiso Reagent(TaKa-Ra公司)抽提細(xì)胞總 RNA。按 RNAiso Reagent操作說(shuō)明書進(jìn)行。紫外分光光度計(jì)分析及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總 RNA的含量、純度及完整性。

引物由 TaKaRa公司設(shè)計(jì)合成,序列如下:Bcl-2:上游,5′-TGA ACC GGC ATC TGC ACA C-3′;下游,5′-CGT CTT CAG AGA CAG CCA GGA G-3′,產(chǎn)物長(zhǎng)度 116 bp;Bax:上游 ,5′-AGA CAC CTG AGCTGA CCT TGG AG-3′;下游 ,5′-GTT GAA GTT GCC ATCAGCAAA CA-3′,產(chǎn)物長(zhǎng)度 197 bp。 β-actin上游:5′-AAG AGA GGC ATC CTG ACC CT-3′;下 游:5′-TAC ATG GCT GGG GTG TTG AA-3′,產(chǎn)物長(zhǎng)度 218 bp。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):在 2700型 PCR System擴(kuò)增儀上按 SYBR ExScriptTMRT-PCR Kit反轉(zhuǎn)錄試劑說(shuō)明書進(jìn)行 cDNA的合成,反應(yīng)參數(shù)為:反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 37℃15 min,反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng) 85℃ 5s。

PCR反應(yīng)采用SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)kit試劑,在 ABI7300熒光定量 PCR儀(美國(guó) ABI公司)上進(jìn)行PCR反應(yīng)。設(shè)置檢測(cè)文件,反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性 10 s;PCR反應(yīng),95℃變性 5 s,60℃退火 31 s,共 40個(gè)循環(huán)。整個(gè)過(guò)程中收集熒光,反應(yīng)結(jié)束后,使用 Sequence Detection software version 1.2.3軟件(Applied Biosystems公司)分析 PCR過(guò)程各檢測(cè)樣

本的 Ct值,Ct值隨模板濃度增大而減少。由融解曲線判斷PCR反應(yīng)的特異性。用 2-△△Ct方法進(jìn)行相對(duì)定量分析〔7〕。分別擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參,每樣本作 3個(gè)復(fù)孔,得到兩組 Ct平均值。 △Ct實(shí)驗(yàn)組=Ct實(shí)驗(yàn)組目的基因-Ct實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參, △Ct對(duì)照組=Ct對(duì)照組目的基因-Ct對(duì)照組內(nèi)參,△△Ct=△Ct實(shí)驗(yàn)組-△Ct對(duì)照組,目的基因的表達(dá)差異以 2-△△Ct表示。

2 結(jié) 果

2.1 OA對(duì) NB4細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用 見(jiàn)表 1。

表1 OA對(duì)NB 4細(xì)胞增殖的影響(±s,n=3)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05;下表同

組別 24 h OD570 IR(%)48 h OD570 IR(%)72 h OD570 IR(%)對(duì)照組 1.55±0.02 - 1.51±0.02 - 1.46±0.03 -40μmol/L組 1.61±0.02 -3.87 1.44±0.04 4.64 1.26±0.021) 13.70 60μmol/L組 1.27±0.051) 18.06 0.97±0.031) 35.76 0.77±0.021) 47.26 80μmol/L組 1.02±0.021) 34.19 0.92±0.041) 39.07 0.69±0.031) 52.74 100μmol/L組 0.95±0.031) 38.71 0.76±0.021) 49.67 0.55±0.031) 62.33

2.2 OA對(duì) NB4細(xì)胞 Bcl-2和 Bax mRNA表達(dá)的影響

2.2.1 OA對(duì)NB4細(xì)胞 Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響 Bcl-2基因的擴(kuò)增曲線和融解曲線見(jiàn)圖 1和圖 2。100μmol/L OA處理NB4細(xì)胞 72h后 Bcl-2mRNA的表達(dá)見(jiàn)表 2,與對(duì)照組相比,OA處理組 Bcl-2 mRNA表達(dá)下降 60%,差異有顯著性(P＜0.05)。

表2 兩組細(xì)胞中 Bcl-2基因表達(dá)相對(duì)值比較(±s,n=3)

表2 兩組細(xì)胞中 Bcl-2基因表達(dá)相對(duì)值比較(±s,n=3)

組別 Ct Bcl-2 Ctβ-actin △Ct △△Ct 2-△△Ct對(duì)照組 20.63±0.49 17.80±1.01 2.83±0.54 0.00±0.54 1.05±0.36實(shí)驗(yàn)組 19.86±0.19 15.77±0.14 4.09±0.33 1.26±0.33 0.42±0.091)

圖1 Bcl-2基因的擴(kuò)增曲線

圖2 Bcl-2基因的融解曲線

2.2.2 OA對(duì) NB4細(xì)胞Bax mRNA表達(dá)的影響 Bax基因的擴(kuò)增曲線和融解曲線見(jiàn)圖 3和圖 4。100μmol/L OA處理 NB4細(xì)胞 72h后Bax mRNA的表達(dá)見(jiàn)表 3。與對(duì)照組相比,OA處理組 Bax mRNA表達(dá)升高 81%,差異有顯著性(P＜0.05)。

圖3 Bax基因的擴(kuò)增曲線

圖4 Bax基因的融解曲線

表3 兩組細(xì)胞中 Bax基因表達(dá)相對(duì)值比較(±s,n=3)

表3 兩組細(xì)胞中 Bax基因表達(dá)相對(duì)值比較(±s,n=3)

組別 Ct Bax Ctβ-actin △Ct △△Ct 2-△△Ct對(duì)照組 28.49±0.07 17.16±0.26 11.33±0.23 0.00±0.23 1.01±0.16實(shí)驗(yàn)組 26.16±0.16 15.69±0.30 10.47±0.21-0.86±0.21 1.83±0.261)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),不同濃度的 OA對(duì)體外培養(yǎng)的人早幼粒白血病NB4細(xì)胞增殖的影響不同。當(dāng)OA的濃度為 40μmol/L時(shí),作用 24 h,對(duì) NB4細(xì)胞的增殖并沒(méi)有抑制作用;作用 48 h,抑制率僅為 4.64%,與對(duì)照組比較差異不顯著;作用 72 h,OA對(duì)NB4細(xì)胞增殖抑制率達(dá) 13.70%,與對(duì)照組比較有顯著性差異。當(dāng)OA的濃度達(dá)到 60μmol/L及以上時(shí),OA則以劑量和時(shí)間依賴的方式抑制 NB4細(xì)胞的增殖。半胱氨酸蛋白酶家族(caspases)以瀑布的方式活化后產(chǎn)生級(jí)聯(lián)效應(yīng)在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔6〕。細(xì)胞凋亡的外部途徑即死亡受體途徑由腫瘤壞死因子家族啟動(dòng),當(dāng) caspase-8被募集到死亡受體復(fù)合物時(shí),該凋亡途徑即被激活。Bcl-2蛋白家族對(duì)細(xì)胞凋亡的線粒體途徑即內(nèi)部途徑起重要的調(diào)節(jié)作用。Bcl-2基因家族成員分為兩類:Bcl-2類為凋亡抑制因子,包括Bcl-2、Bcl-xl和 Bcl-w等;Bax類為凋亡促進(jìn)因子,包括 Bax、Bak和 Box等。當(dāng)?shù)蛲鲆种埔蜃又械?Bcl-2和 Bcl-xl過(guò)表達(dá)時(shí),可阻止細(xì)胞色素 C從線粒體釋放及 caspases的活化,從而抑制凋亡〔7〕。Bax是Bcl-2家族中的促凋亡因子,該分子常常形成自身二聚體,或與Bcl-2/Bcl-xl形成二聚體,游離 Bax或 Bax同型二聚體水平升高可促進(jìn)凋亡〔8〕。Bcl-2已經(jīng)成為藥物抗性機(jī)制研究的主題,因?yàn)?Bcl-2能抑制化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡〔9〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,100μmol/L OA處理 NB4細(xì)胞 72 h后,細(xì)胞凋亡相關(guān)基因 Bcl-2以及 Bax的表達(dá)均發(fā)生明顯變化,表現(xiàn)為抗凋亡的 Bcl-2基因表達(dá)下調(diào),而促凋亡的 Bax基因表達(dá)上調(diào),OA對(duì)NB4細(xì)胞增殖的抑制作用可能是通過(guò)上調(diào) Bax基因的表達(dá)以及下調(diào) Bcl-2基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的;OA可能通過(guò)線粒體途徑而誘導(dǎo) NB4細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究為臨床白血病的化療和天然抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)提供了堅(jiān)實(shí)的依據(jù)。

1 Yan SL,Huang CY,Wu ST,et al.Oleanolic acid and ursolic acid induce apoptosis in four human liver cancer cell lines〔J〕.Toxicol In Vitro,2010;24(3):842-8.

2 Li J,Guo WJ,Yang QY.Effects of ursolic acid and oleanolic acid on human colon carcinoma cell line HCT15〔J〕.World J Gastroenterol,2002;8(3):493-5.

3 黃 煒,黃濟(jì)群,張東方,等 .五環(huán)三萜類化合物抗人肺癌細(xì)胞侵襲和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究〔J〕.中國(guó)肺癌雜志,2003;6(4):254-7.

4 李鴻梅,李雪巖,蔡德富,等 .齊墩果酸對(duì)順鉑耐藥胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制研究〔J〕.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2009;25(10):1334-7.

5 李鴻梅,王敬春,齊占朋,等.齊墩果酸對(duì)順鉑耐藥胃癌 SGC-7901細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2010;30(5):667-9.

6 Konopleva M,Zhao S,Xie Z,et al.Apoptosis.Molecules and mechanisms〔J〕.Adv Exp Med Biol,1998;457:217-36.

7 Kornblau S,Konopleva M,Andreeff M.Apoptosis regulating proteins as targets of therapy for hematological malignancies〔J〕.Expert Opin Investig Drugs,1999;8(12):2027-57.

8 Oltvai ZN,Milliman CL,Korsmeyer SJ.Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog,Bax,that accelerates programmed cell death〔J〕.Cell,1993;74(4):609-19.

9 Yang E,Korsmeyer SJ.Molecular thanatopsis:a discourse on the BCL2 family and cell death〔J〕.Blood,1996;88(2):386-401.