鮮盡紅，何 莉，汪正清

缺血性腦血管病的發(fā)病率、致殘率和病死率都很高，嚴(yán)重危害人類的健康。大腦短暫缺血后，恢復(fù)血供時(shí)會(huì)觸發(fā)一個(gè)強(qiáng)烈的炎癥應(yīng)答，引起腦組織繼缺血后的第2次損傷，即腦缺血/再灌注(ischemia and reperfusion，I/R)損傷。興奮氨基酸中毒、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、自由基及其脂質(zhì)過氧化、炎癥反應(yīng)等在腦缺血的病理生理過程中發(fā)揮著重要的作用。補(bǔ)體作為炎癥反應(yīng)的重要組成部分日益受到重視。研究認(rèn)為，補(bǔ)體系統(tǒng)過度激活的炎癥效應(yīng)片段是腦內(nèi)炎癥反應(yīng)損傷的主要始動(dòng)因素之一［1、2］。腦I/R后補(bǔ)體系統(tǒng)被過度激活，導(dǎo)致白細(xì)胞大量聚集和激活，組織和血管嚴(yán)重?fù)p傷。雖然腦I/R損傷的發(fā)病機(jī)制還不十分明確，但許多實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證明補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)與I/R損傷有直接關(guān)系。

1 腦內(nèi)補(bǔ)體表達(dá)

1．1 腦內(nèi)補(bǔ)體合成 一般認(rèn)為，腦組織是免疫特惠區(qū)，血-腦脊液屏障將腦組織與血液分開，阻止了常規(guī)淋巴細(xì)胞再循環(huán)，限制了大分子物質(zhì)進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)和腦脊液。因此，很少或沒有血漿成分進(jìn)入腦組織。腦內(nèi)補(bǔ)體主要由星形細(xì)胞合成。1987年Levi-Strauss首次證明了腦細(xì)胞能合成補(bǔ)體成分。近年來的研究表明［3］，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)能夠合成包括補(bǔ)體、補(bǔ)體調(diào)控分子及補(bǔ)體受體在內(nèi)的完整的補(bǔ)體系統(tǒng)。人類星形細(xì)胞株在細(xì)胞因子的刺激下能表達(dá)和分泌補(bǔ)體的絕大部分成分，且星形細(xì)胞還能合成細(xì)胞因子，通過自分泌形式調(diào)控腦內(nèi)補(bǔ)體合成。另外，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元均有合成補(bǔ)體的功能［4］。這些研究結(jié)果表明腦組織可以合成完整的補(bǔ)體系統(tǒng)。

1．2 血液補(bǔ)體成分進(jìn)入腦內(nèi) 血-腦脊液屏障由腦內(nèi)毛細(xì)血管和小膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)合的基膜細(xì)胞組成，具有一定的通透性。腦某些區(qū)域(如丘腦正中隆起、垂體、松果體和延髓最后區(qū)等)缺乏構(gòu)成血-腦脊液屏障的血管內(nèi)皮細(xì)胞層、基底膜和星形細(xì)胞終足，由有孔的毛細(xì)血管組成，其解剖特點(diǎn)決定血液中的補(bǔ)體成分可能在生理情況下進(jìn)入腦內(nèi)，但其非腦內(nèi)補(bǔ)體的主要來源。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，腦缺血后腦實(shí)質(zhì)內(nèi)存在補(bǔ)體成分，主要是由于腦血流減少時(shí)腦內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷，血腦屏障通透性改變，血液中的補(bǔ)體向腦內(nèi)滲漏所致;再灌注時(shí)進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)的中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞也可合成補(bǔ)體。

2 腦內(nèi)補(bǔ)體的激活

正常情況下，腦內(nèi)補(bǔ)體系統(tǒng)的激活和抑制處于平衡狀態(tài)。補(bǔ)體通過3條途徑激活，即經(jīng)典途徑、旁路途徑和甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)途徑。生理情況下，腦內(nèi)細(xì)胞(如星形細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞)能分泌抑制物，使腦內(nèi)補(bǔ)體處于平衡狀態(tài)。腦缺血時(shí)，缺血區(qū)pH值和離子濃度改變使細(xì)胞表面補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子減少或缺失，導(dǎo)致C3/C5轉(zhuǎn)化酶活性增高，補(bǔ)體激活增加，腦內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞被破壞，引起MBL沉積，經(jīng)MBL途徑激活補(bǔ)體［5］。血漿與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的抗原物質(zhì)(如髓鞘等)接觸，形成抗原抗體復(fù)合物，通過經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體［6］。腦缺血變性壞死的組織細(xì)胞、變性的蛋白聚集物、受損組織釋放的蛋白水解酶、缺血壞死后釋放的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)(如線粒體)、血腫液中的紅細(xì)胞溶解等能經(jīng)旁路途徑直接激活補(bǔ)體［7］。旁路途徑在I/R損傷中起重要作用，它是腦缺血時(shí)補(bǔ)體激活的重要放大機(jī)制。由此可見，腦I/R發(fā)生后，3種補(bǔ)體激活途徑先后都被不同程度的激活，補(bǔ)體在腦內(nèi)過度活化，導(dǎo)致微血管損傷和神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡［8］。

3 腦內(nèi)補(bǔ)體激活導(dǎo)致腦損傷的機(jī)制

在腦I/R中，補(bǔ)體系統(tǒng)活化產(chǎn)物通過直接或間接的方式介導(dǎo)組織損傷。直接損傷是激活的補(bǔ)體固有成分作用的結(jié)果，間接損傷是由活化的補(bǔ)體成分觸發(fā)的一系列中間反應(yīng)造成的損傷［9］。

3．1 補(bǔ)體C1q C1q是補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑的關(guān)鍵起始因子。研究人員制作小鼠的大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型，發(fā)現(xiàn)在I/R后，手術(shù)一側(cè)的大腦皮層神經(jīng)元在mRNA水平上表達(dá)C1q，而在對(duì)側(cè)幾乎看不到表達(dá)，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組則完全沒有表達(dá)。Van等［10］通過一個(gè)持續(xù)的MCAO模型，應(yīng)用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)到缺血側(cè)大腦皮層有C1qB和C4mRNA的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)在缺血時(shí)能在系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生補(bǔ)體成分。同時(shí)作者認(rèn)為，局部的補(bǔ)體激活可能促成了第2次腦損傷。

3．2 補(bǔ)體C3a和和補(bǔ)體C5a 補(bǔ)體激活產(chǎn)生大量過敏毒素C3a和C5a，促進(jìn)肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞釋放炎癥遞質(zhì)組胺，導(dǎo)致血管通透性增加，破壞血-腦脊液屏障;C3a和C5a還是有效的趨化因子，能夠吸引白細(xì)胞聚集，大量白細(xì)胞在微血管內(nèi)皮局部聚集，穿過內(nèi)皮細(xì)胞，釋放溶酶體酶，使組織蛋白水解，產(chǎn)生自由基和不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能，破壞血-腦脊液屏障。Nishino等［11］建立了一個(gè)大鼠大腦I/R模型，用免疫組織化學(xué)染色的方法證明了在缺血再灌注1天和3天后腦缺血的核心區(qū)有補(bǔ)體成分C3和IgG的存在。由此，作者認(rèn)為在短暫的缺血后，再灌注會(huì)引起血-腦脊液屏障的損傷，中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)抗炎癥的機(jī)制受到破壞。C3a和C5a還可引起巨噬細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、前列腺素和白細(xì)胞三烯，并上調(diào)黏附分子(ICAM)和E-選擇素(E-selectin)。而TNF-α能增加基質(zhì)金屬蛋白酶的含量，可使單核細(xì)胞表達(dá)組織因子，從而激活凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并產(chǎn)生凝血酶，凝血酶在腦出血早期腦水腫發(fā)生過程中起重要作用。C5a與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體結(jié)合后產(chǎn)生氧自由基，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，也可產(chǎn)生彈性蛋白酶以擾亂內(nèi)皮細(xì)胞間連接，改變血-腦脊液屏障的通透性，從而破壞屏障功能。體外研究證實(shí)，C5a對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡起直接神經(jīng)毒性作用，而腦出血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡又可加重繼發(fā)性腦損害。

3．3 補(bǔ)體C5b-9(攻膜復(fù)體物)［C5b-9(MAC)］ 再灌注損傷中補(bǔ)體的最后共同途徑都是形成MAC。研究者提出，開始的局部缺血導(dǎo)致細(xì)胞丟失了在膜水平調(diào)節(jié)補(bǔ)體循環(huán)的能力，MAC在細(xì)胞膜上的沉積，最后會(huì)引起一系列急性缺血和血流較少的部位形成不可逆的損傷。此外，MAC在再灌注的上皮細(xì)胞內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，這可能是MAC導(dǎo)致了內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。亞溶解濃度的MAC可能啟動(dòng)血液的凝固和內(nèi)皮的回縮，引起微血管衰竭和組織氧化損傷。MAC可直接插入細(xì)胞表面，形成雙向親水孔道，使Ca2+內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)丟失，最終細(xì)胞發(fā)生滲透性溶解死亡。紅細(xì)胞溶解后釋放出血紅蛋白，后者具有神經(jīng)毒性，能引起腦水腫［12］。MAC可插入神經(jīng)元、星形細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡和BBB破壞。MAC能破壞細(xì)胞膜，增加組織因子活性，從而激活外源性凝血途徑，導(dǎo)致凝血酶產(chǎn)生增加。MAC還可沉積于細(xì)胞膜，使細(xì)胞分泌組胺、細(xì)胞間黏附分子-1、E-選擇素、P-選擇素和血小板活化因子等引起細(xì)胞膜滲透性增加和細(xì)胞水腫 ，破壞血-腦脊液屏障，還可直接激活單核細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞因子、活性氧自由基和金屬基質(zhì)蛋白酶等的產(chǎn)生，引起遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，加劇炎癥反應(yīng)。Casarsa等［13］將有溶細(xì)胞活性的MAC注入大鼠側(cè)腦室，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射6小時(shí)后大鼠脈絡(luò)叢和腦膜血管白細(xì)胞滲出增多，細(xì)胞間黏附分子-1表達(dá)增加，腦脊液中性粒細(xì)胞趨化性蛋白-1和單核細(xì)胞趨化性蛋白-1水平增高，而且在腦室周圍和腦脊液中發(fā)現(xiàn)IL-1表達(dá)。這說明MAC可通過多種途徑導(dǎo)致炎癥損傷。

4 補(bǔ)體抑制劑在腦缺血再灌注中的應(yīng)用研究

通過大量的實(shí)驗(yàn)研究，越來越多的證據(jù)表明補(bǔ)體在大腦I/R損傷中起重要作用。因此，研究補(bǔ)體抑制劑以減輕I/R損傷，為臨床治療缺血性腦病帶來了新的策略。針對(duì)補(bǔ)體的激活途徑，目前補(bǔ)體抑制劑的研究主要有以下幾大類。

4．1 補(bǔ)體受體Ⅰ型(omplement receptor type 1，CR1)分子是C3b/C4b的受體，是一種單鏈的膜結(jié)合糖蛋白，分布于多種細(xì)胞表面，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)組成。在人群中最常見的基因型為F的CR1胞外區(qū)由30個(gè)短同源重復(fù)序列(short consensus repeat，SCR)組成，每7個(gè)SCR為1組，構(gòu)成4個(gè)長同源重復(fù)序列(LHRs)。LHR A中的前3個(gè)SCR組成有功能的位點(diǎn)Ⅰ，而LHR B和LHR C中的前3個(gè)SCR有3個(gè)氨基酸不同，但有相同的功能，都稱為位點(diǎn)Ⅱ。LHR-A中有一個(gè)C4b結(jié)合位點(diǎn)，LHR-B和LHR-C有C3b結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步研究證實(shí)［14］，C4b的結(jié)合殘基在SCR 1-3，C3b的結(jié)合殘基在SCR8-10或15-17。可溶性補(bǔ)體受體Ⅰ型(sCR1)是CR1的胞外片段，功能性位點(diǎn)Ⅰ和位點(diǎn)Ⅱ都在 sCR1內(nèi)。Huang等［15］建立小鼠大腦缺血再灌注模型，并在術(shù)前給予sCR1治療。研究表明，在sCR1治療組，小鼠的神經(jīng)損傷顯著減輕，中性粒細(xì)胞和血小板的聚集減少，梗死面積也有減小的趨勢(shì)。它作為一個(gè)高效的補(bǔ)體抑制劑備受關(guān)注。

4．2 C5a單克隆抗體 抗C5a的單克隆抗體可以特異性地抑制C5裂解成C5a和C5b-9，阻止這些促炎反應(yīng)遞質(zhì)的增加。在大鼠MCAO動(dòng)物模型上顯示［16］，抗C5a單克隆抗體組較對(duì)照組腦梗死面積減小，水腫減輕，中性粒細(xì)胞聚集降低，并且運(yùn)動(dòng)的神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分明顯提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抗C5a單克隆抗體能夠減輕腦缺血再灌注引起的損傷。

4．3 C1酯酶抑制劑(C1-INH)C1-INH能共價(jià)結(jié)合補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑的絲氨酸蛋白酶C1s、C1r，MBL途經(jīng)中與絲氨酸蛋白酶1(MASP1)和絲氨酸蛋白酶2(MASP2)結(jié)合［17］。De Simoni等［18］在小鼠MCAO的模型上靜脈給予C1-INH后對(duì)神經(jīng)元有保護(hù)作用。在缺血48小時(shí)后，C1-INH能夠明顯減輕神經(jīng)元丟失，梗死面積減少。中性紅染色顯示對(duì)大腦皮質(zhì)、海馬和紋狀體都有很好的保護(hù)作用。用CD45的免疫組織化學(xué)染色顯示，中性粒細(xì)胞浸潤明顯降低。以上顯示C1-INH在防治腦缺血再灌注損傷中治療價(jià)值。

4．4 眼鏡蛇毒因子(cobra venom factor，CVF)CVF是一種來源于眼鏡蛇毒性物質(zhì)的抗補(bǔ)體蛋白，可與B因子結(jié)合形成穩(wěn)定的C3/C5轉(zhuǎn)化酶，導(dǎo)致補(bǔ)體被快速和持續(xù)地消耗［19］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用CVF耗竭大鼠體內(nèi)的補(bǔ)體后向其腦內(nèi)注入自體動(dòng)脈血，2小時(shí)后血腫周圍腦組織TNF-α的產(chǎn)生減少，補(bǔ)體C3d、C5a、C9和中性粒細(xì)胞聚集的標(biāo)志——髓過氧化物酶(MPO)陽性細(xì)胞數(shù)均減少，4、72小時(shí)后補(bǔ)體沉積較對(duì)照組明顯減少，腦含水量顯著減少。實(shí)驗(yàn)提示，CVF是一個(gè)潛在的可以非特異性地抑制補(bǔ)體減輕I/R損傷。

5 小結(jié)

腦缺血再灌注后補(bǔ)體系統(tǒng)通過缺血后變性壞死的組織細(xì)胞等經(jīng)旁路途徑直接激活補(bǔ)體，但也可經(jīng)經(jīng)典和MBL途徑不同程度地被激活。補(bǔ)體系統(tǒng)激活產(chǎn)物C3a、C4a、C5a和C5b－9等在腦缺血再灌注炎癥損傷中起主要作用，其作用機(jī)制尚不完全清楚。目前抗補(bǔ)體的藥物雖多，但尚無一種人工抑制補(bǔ)體制劑在特異性和有效性方面能滿足臨床應(yīng)用的要求。所以，尋求新的的治療策略是亟待攻克的重要課題。CR1、C1-INH等補(bǔ)體抑制劑具有較好的抑制補(bǔ)體效果，但距離真正應(yīng)用到臨床尚有一定的距離，其中還有不少的問題需要解決。但可以相信特異性補(bǔ)體抑制劑的研究將會(huì)為腦缺血再灌注損傷等多種相關(guān)性疾病的治療提供一條新的途徑。

［1］ MorrisonH，F(xiàn)rye J，Davis-GormanG，et al．The contribution of mannose binding lectinto reperfusioninjury after ischemic stroke［J］．Cur Neurovascular Res，2011，8(1):52 －63．

［2］ ElvingtonA，AtkinsonC，Kulik L，et al．Complement activationand cerebral injury following ischemic stroke［J］．Mol Immunol，2010，47(13S4):2198．

［3］ Arumugam TV，Woodruff TM，Lathia JD，et al．Neuroprotectioninstroke by complement inhibitionand immunoglobulintherapy［J］．Neuroscience，2009，158(3):1074 －1089．

［4］ Cowell RM，Plane JM，SilversteinFS．Complement activationcontributes to hypoxic － ischemic braininjury inneonatal rats［J］．J Neurosci，2003，23(28):9459 －9468．

［5］ NielsenEW，Waage C，F(xiàn)ure H，et al．Effect of supraphysiologic levels of C1 － inhibitor onthe classical，lectinand alternative pathways of complement［J］．Mol Immunol，2007，44(8):1819 － 1826．

［6］ Diepenhorst GM，vanGulik TM，Hack CE，et al．Complement－ mediated ischemia－reperfusioninjury:lessons learned from animal and clinical studies［J］．AnnSurg，2009，249(6):889 －899．

［7］ Holers VM．The spectrum of complement alternative pathway－mediated diseases［J］．Immunol Rev，2008，223(1):300 －316．

［8］ Szeplaki G，Szegedi R，Hirschberg K，et al．Strong complement activationafter acute ischemic stroke is associated with unfavorable outcomes［J］．Atherosclerosis，2009，204(1):315 － 320．

［9］ PanJ，Konstas AA，BatemanB，et al．Reperfusioninjury following cerebral ischemia:pathophysiology，MR imaging，and potential therapies［J］．Neuroradiology，2007，49(2):93 －102．

［10］ VanBJ，ChanP，BernaudinM，et al．Glial responses，clusterin，and complement inpermanernt focal cerebral ischemia inthe mouse［J］．Glia，2000，31(1):39 －50．

［11］ Nishino H，Czurko A，F(xiàn)ukuda A，et al．Pathophysiological process after transient ischemia of the middle cerebral artery inthe rat［J］．BrainRes Bull，1994，35(1):51 －56．

［12］ Huang FP，Xi G，Keep RF，et al．Brainedema after experimental intracerebral hemorrhage:role of hemoglobindegradationproducts［J］．J Neurosurg，2002，96(2):287 －293．

［13］ Casarsa C，De Luigi A，Pausa M，et al．Intracerebroventricular injection of the terminal complement complex causes inflammatory reactioninthe rat brain［J］．Eur J Immunol，2003，33(5):1260 －1270．

［14］ Furtado PB，Huang CY，Ihyembe D，et al．The partly folded back solutionstructure arrangement of the 30 SCR domains inhumancomplement receptor type 1(CR1)permits access to its C3b and C4b ligands［J］．J Mol Biol，2008，375(1):102 －118．

［15］ Huang J，Kim LJ，Mealey R，et al．Neuronal protectioninstroke by ansLex-glycosylated complement inhibitory protein［J］．Science，1999，285(5427):595 －599．

［16］ Costa C，Zhao L，ShenY，et al．Role of complement component C5 incerebral ischemia/reperfusioninjury［J］．BrainRes，2006，1100(1):142－151．

［17］ Storini C，Rossi E，Marrella V，et al．C1 － inhibitor protects against brainischemia－reperfusioninjury via inhibition of cell recruitment and inflammation［J］．Neurobiol Dis，2005，19(1 －2):10 －17．

［18］ De Simoni MG，Storini C，Barba M，et al．Neuroprotectionby complement(C1)inhibitor inmouse transient brainischemia［J］．J Cereb Blood Flow Metab，2003，23(2):232 －239．

［19］ Vogel CW，F(xiàn)ritzinger DC．Humanized cobra venom factor:experimental therapeutics for targeted complement activationand complement depletion［J］．Curr Pharmaceutical Design，2007，13(28):2916－2926．