朱松雷 綜述,沈 策審校

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院肺內(nèi)科 200233)

銅綠假單胞菌密度感應(yīng)系統(tǒng)的研究進(jìn)展

朱松雷 綜述,沈 策△審校

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院肺內(nèi)科 200233)

假單胞菌,銅綠;生物膜;密度感應(yīng)系統(tǒng)

銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa,PA),屬于非發(fā)酵菌類假單胞菌屬。它廣泛分布于自然界并在人體皮膚上定植,是引起肺囊性纖維化(cystic fibrosis,CF)和彌漫性泛支氣管炎(diffuse panbroncbiolitis,DPB)的最重要的病原菌,也是近年來醫(yī)院內(nèi)感染的重要條件致病菌和耐藥菌之一。其中密度感應(yīng)(quorum sensing,QS)系統(tǒng)作為細(xì)菌細(xì)胞間的特殊交流方式,在基因水平上調(diào)控著PA生物被膜、Ⅲ型分泌系統(tǒng)、致病毒力因子等的分化,是重要的致病因素和耐藥性原因之一?，F(xiàn)將PA的QS系統(tǒng)的研究進(jìn)展作一綜述。

1 PA的QS系統(tǒng)調(diào)控模式

有研究顯示,QS系統(tǒng)是細(xì)菌細(xì)胞間信號傳遞的一種方式。指許多種類的細(xì)菌在高細(xì)胞密度的條件下,通過化學(xué)信號分子,幫助細(xì)胞監(jiān)控細(xì)胞群體的濃度變化。QS系統(tǒng)能讓細(xì)菌細(xì)胞感知其同伴的密度變化,當(dāng)達(dá)到一定的閾值后,就會出現(xiàn)異常的多樣的細(xì)胞行為模式。革蘭陰性細(xì)菌的QS系統(tǒng)大多利用N-乙酰高絲氨酸內(nèi)酯(N-acyl homoserine lactones,AHLs)作為信號分子。PA擁有一個復(fù)雜的QS信號網(wǎng)絡(luò),包括兩個AHLs依賴的細(xì)胞間信號系統(tǒng),即las系統(tǒng)和rhl系統(tǒng),一個非AHLs依賴的細(xì)胞間信號分子,即4-羥基-2烷基喹諾酮(4-hydroxy-2-alkylquinolines,HAQs)。las系統(tǒng)由LasR和LasI組成,LasI指導(dǎo)PA信號分子N-3-氧代十二烷酰-高絲氨酸內(nèi)酯(3-oxododecanoyl homoserine lactone,3-O-C12-HSL)的合成;rhl系統(tǒng)由RhlR和 RhlI組成,RhlI指導(dǎo) PA信號分子N-丁?；?高絲氨酸內(nèi)酯(N-butyryl-L-homoserinelactone,C4-HSL)的合成。當(dāng)3-O-C12-HSL和C4-HSL信息分子增加到一定濃度的時候,分別與轉(zhuǎn)錄因子LasR和RhlR特異性結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄從而調(diào)節(jié)一系列下游致病基因的表達(dá)。las系統(tǒng)和rhl系統(tǒng)均可以調(diào)控自身lasI和 rhlI基因的表達(dá)形成正反饋回路。HAQs包括4-羥基-2庚基喹諾酮衍生物(2-heptyl-4-quinolone,HHQ)和對應(yīng)的2羥基衍生物,比如2羥基-3,4二庚基喹諾酮(2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone,PQS,假單胞菌喹諾酮信號)[1]。PA HAQs的生物合成需要操縱子 pqsABCDE和phnAB來編碼基因。HHQ由來自鄰氨基苯甲酸的PqsABCD合成[2]。PQS是通過 HHQ的羥基化合成的。HHQ和 PQS作為多種毒力調(diào)節(jié)因子的共同誘導(dǎo)配體而對pqsABCDE和phnAB的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)起作用[3]。

2 QS系統(tǒng)與PA生物被膜的關(guān)系

細(xì)菌生物被膜(biofilm,BF)是細(xì)菌在生長過程中,為適應(yīng)生存環(huán)境而吸附于惰性或活性材料表面形成的一種與浮游細(xì)菌相對應(yīng)的生長方式,由細(xì)菌和自身分泌的細(xì)胞外基質(zhì)組成。有研究認(rèn)為,PA之所以形成扁平、均一不分化的BF,是由于LasI基因的突變,故不能形成成熟的三維立體結(jié)構(gòu)。當(dāng)加入合成的信號分子3-O-C12-HSL共同培養(yǎng)后,可使突變株恢復(fù)形成成熟生物膜的能力。根據(jù)BF結(jié)構(gòu)的改變推測,對于 PA成熟BF的形成和BF的耐藥性而言,lasQS系統(tǒng)比rhl系統(tǒng)顯得更為重要。同時亦提示胞外多糖(extrapolysaccharides,EPS)的合成可能受到lasI和 rhlI表達(dá)的影響[4]。Davey和Caiazza等[5]研究發(fā)現(xiàn),群集在插管患者管內(nèi)的 PA菌群絕大多數(shù)均為QS系統(tǒng)菌,在PA生物被膜中都能檢測出3-O-C12-HSL和C4-HSL,前者在生物被膜分化中起作用,后者在成熟階段起作用。如果沒有QS系統(tǒng)的參與BF將不能分化成熟,對抗菌藥物的敏感性也與浮游菌相似。有研究顯示,QS系統(tǒng)能夠決定PA生物被膜對抗生素治療耐受性,并且啟動著由多形核白細(xì)胞(polymorphonuclear cells,PMNs)主導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[6]。所以QS系統(tǒng)在PA生物被膜分化,形成上起著重要作用[7]。

3 QS系統(tǒng)與Ⅲ型分泌系統(tǒng)

有研究發(fā)現(xiàn),PA成功感染宿主細(xì)胞導(dǎo)致疾病的重要原因是其能夠通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)(typeⅢsecretionsystem,T3SS)的作用,將病原菌的效應(yīng)分子(以毒力蛋白為主)注入到真核宿主細(xì)胞內(nèi)部,從而導(dǎo)致許多疾病[8]。PA的 T3SS分子結(jié)構(gòu)和其他革蘭氏陰性致病菌(如耶爾森氏菌屬,沙門氏菌屬)一樣,由細(xì)菌膜上的裝置蛋白、轉(zhuǎn)位子蛋白、被轉(zhuǎn)移的效應(yīng)分子和T3SS分子伴侶4類蛋白組成。Rhl是 PA QS系統(tǒng)之一。有研究發(fā)現(xiàn),T3SS的表達(dá)在 Rhl QS系統(tǒng)的缺失突變株中升高[9]。最近,有研究通過基因敲除的方法破壞 PA QS系統(tǒng)中的相關(guān)基因,將 T3SS相關(guān)基因啟動子報道子融合體整合到野生型菌株及QS系統(tǒng)突變菌株的染色體組織上,研究QS系統(tǒng)與 T3SS間的相互關(guān)系,結(jié)果表明,除Rhl系統(tǒng)對 T3SS具有負(fù)調(diào)節(jié)作用以外,PQS信號分子介導(dǎo)的QS系統(tǒng)對T3SS相關(guān)基因表達(dá)也有明顯的負(fù)調(diào)節(jié)作用,這一作用對PA的致病過程有重要影響[10]。

4 QS系統(tǒng)與大環(huán)內(nèi)酯類藥的關(guān)系

大環(huán)內(nèi)酯類藥物通過結(jié)合細(xì)菌的50S核糖體而抑制了細(xì)菌蛋白的翻譯。然而,因為低于最小抑菌濃度(subminimal inhibitory concentration,sub-Mic)的大環(huán)內(nèi)酯類藥物也能夠抑制PA感染的CF和DPB,故被認(rèn)為是由其他機(jī)制所介導(dǎo)的,比如說毒力因子產(chǎn)生的減少等[11]。有研究顯示,sub-Mic的阿奇霉素并不能改變QS相關(guān)的基因(lasI,lasR,rhlI,rhlR,vft,rsaL)mRNA的表達(dá),但是能夠降低lasI和rhlI上游AHL合成酶的表達(dá)。在sub-Mic的阿奇霉素溶液中,QS的自身誘導(dǎo)分子減少了。有研究認(rèn)為,阿奇霉素抗PA的作用機(jī)制為低濃度的阿奇霉素抑制了S-腺苷-甲硫氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)合成酶的表達(dá),并且減少了細(xì)胞內(nèi)SAM的濃度。SAM的減少又導(dǎo)致了QS系統(tǒng)中LasI和RhlI產(chǎn)生AHL的減少。從而與AHL結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子(LasR/RhlR)的減少進(jìn)一步導(dǎo)致了毒力因子釋放的減少[12]。

5 QS系統(tǒng)與宿主的關(guān)系

PA QS系統(tǒng)能夠改變宿主的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)[13]。有研究顯示,QS系統(tǒng)能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞外酶和細(xì)胞溶解酶(鼠李糖脂)等毒力因子的產(chǎn)生,并且QS系統(tǒng)作為一種抵抗巨噬細(xì)胞的保護(hù)屏,在 PA感染的致病機(jī)制中起著重要的作用[14-15]。Davis等[16]研究證明,在 PA QS系統(tǒng)中的AHLs在微摩爾水平就可以直接插入嵌在宿主細(xì)胞的生物膜上,其自身誘導(dǎo)分子3-O-C12-HSL能影響血管平滑肌的收縮,顯著的心動過緩,調(diào)節(jié)著上皮細(xì)胞的連接完整性和細(xì)胞旁的滲透性[17]。在免疫反應(yīng)中,3-O-C12-HSL能刺激不同宿主信號途徑來抑制或激活免疫細(xì)胞反應(yīng),而 C4-HSL則不能。有研究發(fā)現(xiàn),3-O-C12-HSL分子能夠刺激宿主 T細(xì)胞干擾素-γ(interferon-gamma,IFN-γ)的產(chǎn)生,刺激人肺纖維母細(xì)胞中白介素(interleukin,IL)-8的產(chǎn)生,抑制IL-12和腫瘤壞死因子α在巨噬細(xì)胞中的表達(dá),促進(jìn)在IL-4誘導(dǎo)下的單核細(xì)胞免疫球蛋白 E的產(chǎn)生,并且可引起巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的凋亡等[18]。

6 QS系統(tǒng)抑制劑的探索

QS系統(tǒng)是PA感染的重要調(diào)節(jié)因素。QS系統(tǒng)抑制劑雖然對細(xì)菌的生長沒有直接的影響,但能改變細(xì)菌病原基因,因此,能夠增加病原菌對宿主免疫的易感性。近10年有專利的QS系統(tǒng)抑制劑(自然和人工合成制品)大致可以分為3類:非肽類小分子、肽類和蛋白質(zhì)。這些抑制劑通過抑制QS信號的產(chǎn)生,阻斷信號受體或者破壞QS往來干擾QS。提供1個可供選擇的方法來控制細(xì)菌的發(fā)病機(jī)制。最早發(fā)現(xiàn)的天然QS抑制劑來源于1種海洋紅藻,它能夠產(chǎn)生與AHLs信號分子結(jié)構(gòu)類似的鹵代呋喃酮化合物。近期有研究發(fā)現(xiàn),入侵紅火蟻體內(nèi)的生物堿Solenopsin A能夠有效的阻斷PA的QS系統(tǒng)。外源添加C4-HSL能夠有效的恢復(fù)QS系統(tǒng),提示Solenopsin A的作用靶點(diǎn)主要是依賴C4-HSL的rhlQS系統(tǒng)[19]。在對小分子化合物庫進(jìn)行篩選中,Müh等[20]研究發(fā)現(xiàn),兩個與3-OC12-HSL結(jié)構(gòu)類似的抑制劑V-06-018和 PD12。這兩個化合物都能與LasR蛋白結(jié)合,并能夠抑制彈性蛋白酶和綠膿菌素的產(chǎn)生。Kaufmann等[21]研究發(fā)現(xiàn),單克隆抗體 RS2-1G9與PA信號分子3-O-C12-HSL的親和力最高,并證實,該抗體能抑制PA中的QS系統(tǒng),有效保護(hù)小鼠巨噬細(xì)胞免受3-O-C12-HSL信號分子的毒害。1種在各種生物體內(nèi)廣泛分布依賴ATP的Lon蛋白酶也能夠抑制PA的QS系統(tǒng)。其作用機(jī)制不是直接降解AHL,而是通過降解AHL合成酶LasI和 RhlI來抑制AHL的合成。近期有研究發(fā)現(xiàn),1種能夠降解PQS信號分子的酶——2,4-雙加氧酶(2,4-dioxygenase,Hod)。在PA PAO1培養(yǎng)物中外源添加 Hod蛋白能夠降低 PQS合成基因pqsA的表達(dá)以及受 PQS調(diào)節(jié)的毒力因子凝集素A、綠膿菌素、鼠李糖脂的表達(dá)[22]。近年來有研究發(fā)現(xiàn),中藥人參通過抑制QS系統(tǒng)的作用而使得PA的感染改善[23],氨溴索能夠抵抗PA的QS系統(tǒng)而使得CF的患者治療有改善,并減少生物被膜的形成和管道的定植[24]。這些化合物以及類似物為治療PA感染提供了廣闊的前景。QS系統(tǒng)廣泛存在于原核生物和真核生物中,并已成為目前的一個研究熱點(diǎn)。QS系統(tǒng)在 PA的分化和生長過程中的地位非常重要。通過對 PA的QS系統(tǒng)研究,會進(jìn)一步認(rèn)識到它的致病機(jī)制,從而在調(diào)控或干擾QS系統(tǒng)角度上來治療PA引起的相關(guān)感染開辟了一個新的方向。

[1]Lepine F,Milot S,Deziel E,et al.Electrospray/mass spectrometric identification and analysis of 4-hydroxy-2-alkylquinolines(HAQs)produced by Pseudomonas aeruginosa[J].Am Soc Mass Spectrom,2004,15(6):862-869.

[2]Bredenbruch F,Nimtz M,Wray V,et al.Biosynthetic pathway of Pseudomonas aeru-ginosa 4-hydroxy-2-alkylquinolines[J].Bacteriol,2005,187(11):3630-3635.

[3]Wade DS,Calfee MW,Rocha ER,et al.Regulation of pseudomonas quinolone signal synthesis in Pseudomonas aeruginosa[J].Bacteriol,2005,187(13):4372-4380.

[4]楊新云,卓超,陳斯韻.銅綠假單胞菌生物被膜耐藥研究進(jìn)展[J].Pharmacy Today,2009,19(11):6-8.

[5]Davey ME,Caiazza NC.Rhamnolipid surfactant production affects biofilm architecture in Pseudomonas aeruginosa PAO1[J].Bacteriol,2003,185(3):1027-1036.

[6]Bjarnsholt T,Jensen P?,Burm?lle M,et al.Pseudom on as aeruginosa tolerance to tobramycin,hydrogen peroxide and polymorphonuclear leukocytes is quorum-sensing dependent[J].Microbiology,2005,151(Pt 2):373-383.

[7]H?iby N,Bjarnsholt T,Givskov M,et al.Antibiotic resistance of bacterial biofilms[J].Int J Antimicrob A-gents,2010,35(4):322-332.

[8]Coburn B,Sekirov I,Finlay BB.TypeⅢsecretion systems and disease[J].Clin Microbiof Rev,2007,20(4):535-549.

[9]胡曉梅,胡福泉.銅綠假單胞菌的細(xì)胞間信號聯(lián)系及其在感染中的作用[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2006,16(4):478-480.

[10]孔偉娜,梁海華,沈立新,等.銅綠假單胞菌中Ⅲ型分泌系統(tǒng)受Rhl和 PQS群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)[J].微生物學(xué)報,2009,49(9),1158-1164.

[11]Tateda K,Ishii Y,Kimura S,et al.Suppression of Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing systems by macrolides:a promising strategy or an oriental mystery[J].J Infect Chemother,2007,13(6):357-367.

[12]Kai T,Tateda K,Kimura S,et al.A low concentration of azithromycin inhibits the mRNA expression of N-acyl homoserine lactone synthesis enzymes,upstream of lasI or rhlI,in Pseudomonas aeruginosa[J].Pulm Pharmacol T-her,2009,22(6):483-486.

[13]Cooley M,Chhabra SR,Williams P.N-Acylhomoserine lactone-mediated quorum sensing:a twist in the tail and a blow for host immunity[J].Chem Biol,2008,15(11):1141-1147.

[14]Van Gennip M,Christensen LD,Alhede M,et al.Inacti-vation of the rhlA gene in Pseudomonas aeruginosa prevents rhamnolipid production,disabling the protection against polymorphonuclear leukocytes[J].APMIS,2009,117(7):537-546.

[15]Alhede M,Bjarnsholt T,Jensen P?,et al.Pseudomonas aeruginosa recognizes and responds aggressively to the presence of polymorphonuclear leukocytes[J].Microbio logy,2009,155(11):3500-3508.

[16]Davis BM,Jensen R,Williams P,et al.The interaction of N-acylhomoserine lactone quorum sensing signaling molecules with biological membranes:implications for interkingdom signaling[J].PLoS One,2010,5(10):3522.

[17]Vikstr?m E,Bui L,Konradsson P,et al.The junctional integrity of epithelial cells is modulated by Pseudomonas aeruginosa quorum sensing molecule through phosphorylation-dependent mechanisms[J].Exp Cell Res,2009,315(2):313-326.

[18]Smith RS,Iglewski BH.P.aeruginosa quorum-sensing systems and virulence[J].Curr Opin Microbiol,2003,6(1):56-60.

[19]Park J,Kaufmann GF,Bowen J P,et al.Solenopsin A,a venom alkaloid from the fire ant solenopsis invicta,inhibits quorum-sensing signaling in Pseudomonas aeruginosa[J].J Infect Dis,2008,198(8):1198-1201.

[20]Müh U,Schuster M,Heim R,et al.Novel Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing inhibitors identified in an ultra-high-throughput screen[J].Antimicrob Agents Chemother,2006,50(11):3674-3679.

[21]KaufmannGF,Park J,Mee JM,et al.The quorum quenching antibody RS2-1G9 protects macrophages from the cytotoxic effects of the Pseudomonas aeruginosa quorum sensing signalling molecule N-3-oxo-dodecanoylhomoserine lactone[J].Mol Immunol,2008,45(9):2710-2714.

[22]Pustelny C,Albers A,Büldt-Karentzopoulos K,et al.Dioxygenase-mediated quenching of quinolone-dependent quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa[J].Chem Biol,2009,16(12):1259-1267.

[23]Song Z,Kong KF,Wu H,et al.Panax ginseng has anti-infective activity against opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa by inhibiting quorum sensing,a bacterial communication process critical for establishing infection[J].Phytomedicine,2010,17(13):1040-1046.

[24]Lu Q,Yu J,Yang X,et al.Ambroxol interferes with Pseudomonas aeruginosa quorum sensing[J].Int J Antimicrob Agents,2010,36(3):211-215.

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