賈　娜，孔保華*，張洪濤

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

黑加侖花色苷的提取及抗氧化活性研究

賈娜，孔保華*，張洪濤

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

采用溶劑提取法對(duì)黑加侖花色苷進(jìn)行提取，通過(guò)測(cè)定花色苷提取量、2,2-二苯基-1-間三硝基苯基聯(lián)肼(DPPH)自由基清除率、還原能力綜合確定最佳提取條件，以獲得具有較高提取量和較高抗氧化活性的黑加侖花色苷提取液，并將提取液與丁羥基茴香醚(BHA)和抗壞血酸的抗氧化能力進(jìn)行比較。結(jié)果表明：黑加侖花色苷最佳提取工藝為提取溶劑乙醇鹽酸溶液，其中乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、提取料液比1∶10(g/mL)、提取時(shí)間2h，所得提取液的花色苷質(zhì)量濃度為86.15mg/L，即凍果中提取量為172.29mg/100g，此時(shí)提取液的DPPH自由基清除率為71.64%，還原能力為1.64(以A700表示)；花色苷質(zhì)量濃度0.1mg/mL的提取液較同質(zhì)量濃度的BHA和抗壞血酸具有更高的還原能力和自由基清除能力(P＜0.05)。因此，黑加侖富含具有較強(qiáng)抗氧化能力的花色苷，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

黑加侖；花色苷；提取；抗氧化能力

食品中的合成抗氧化劑對(duì)人體具有潛在的危害[1]，因此，開(kāi)發(fā)天然抗氧化劑尤為重要。花色苷作為植物的主要呈色物質(zhì)不但具有較強(qiáng)的自由基清除能力和抗氧化能力，還具有潛在的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)療價(jià)值[2]。紫黑色小漿果和葡萄中的花色苷含量豐富，黑加侖作為小漿果的一種，鮮果花色苷含量可達(dá)201mg/100g[3]，黑加侖果實(shí)及其制品呈現(xiàn)深紅色則是由于高含量的花色苷所致。水溶性花色苷主要存在于黑加侖的果皮中，總花色苷含量至少為2000mg/kg新鮮果皮[4]。早在1977年Koeppen等[5]就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)黑加侖含有豐富的花色苷。國(guó)外對(duì)于黑加侖花色苷的研究主要集中在黑加侖花色苷的提取[2,4]、花色苷單體的分離鑒定[6]和穩(wěn)定性分析[7]。國(guó)內(nèi)對(duì)黑加侖花色苷的提取、純化和鑒定有一定的研究[8-9]，但較少考慮提取條件對(duì)抗氧化能力的影響，大部分研究?jī)H以花色苷含量作為衡量指標(biāo)。本研究對(duì)不同提取條件下的花色苷提取量和抗氧化能力同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，確定黑加侖花色苷最佳提取條件，將花色苷與相同濃度的抗氧化劑丁羥基茴香醚(butylated hydroxyanisole，BHA)、抗壞血酸進(jìn)行比較，探討其抗氧化效果。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

黑加侖凍果，購(gòu)自哈爾濱高泰食品公司，-18℃保存。

2,2-二苯基-1-間三硝基苯基聯(lián)肼(DPPH)、2,2'氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽(ABTS)、2-D-脫氧核糖 美國(guó)Sigma公司；丁羥基茴香醚、抗壞血酸、鄰苯三酚、Tris堿、硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)、三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

UT-1800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；DK-8B型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；AL-104型精密電子天平 上海梅特勒-托利多儀器設(shè)備有限公司；pHS-25型pH計(jì) 上海精科雷磁儀器廠。

1.3方法

1.3.1黑加侖花色苷的提取

取黑加侖凍果適量，室溫解凍后，放入攪拌機(jī)中攪碎。稱取5g破碎后的黑加侖，在一定條件下用提取溶劑于35℃浸提，真空抽濾，所得濾液用于測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.2單因素試驗(yàn)

分別考察不同提取溶劑、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間和鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)花色苷提取量和提取液的還原能力、DPPH自由基清除能力的影響，通過(guò)單因素試驗(yàn)確定最佳提取條件。

1.3.3花色苷提取量測(cè)定

采用pH示差法[10]。取適量提取液，分別用pH1.0的KCl-HCl緩沖液(0.025mol/L)和pH4.5的乙酸鈉-HCl緩沖液(0.4mol/L)稀釋至適當(dāng)倍數(shù)(使pH1.0時(shí)的吸光度在0.2～0.7之間)，放置15min后，于波長(zhǎng)520nm處測(cè)定吸光度，按下式計(jì)算凍果中的花色苷提取量：

式中：449.29是矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量/ (g/mol)；DF是稀釋倍數(shù)；V是提取溶劑的體積/mL；26900是矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)/(L·mol/cm)；m是黑加侖的質(zhì)量/g；1是比色皿的光路長(zhǎng)度/cm。

1.3.4還原能力的測(cè)定

采用Oyaizu等[11]的方法。0.5mL待測(cè)液與2.5mL磷酸鹽緩沖液(pH6.6，0.2mol/L)和2.5mL 1%鐵氰化鉀混合，50℃保溫20min，快速冷卻后，加入10% TCA 2.5mL，3000r/min離心10min，取上清液5mL，加入5mL蒸餾水和1mL 0.1%氯化鐵溶液，混勻后放置10min，于700nm測(cè)定吸光度。用吸光度A700直接表示還原力，吸光度越大還原能力越強(qiáng)。

1.3.5DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參照Yang等[12]的方法。0.1mL待測(cè)液與3.0mL 0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液混合，室溫避光反應(yīng)30min，波長(zhǎng)517nm處測(cè)定吸光度，按下式計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：Ac為對(duì)照的吸光度；As為樣品的吸光度。

1.3.6超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定

參照Xiang等[13]的方法并稍加修改。0.1mL待測(cè)液與2.85mL Tris-鹽酸(pH8.2，50mmol/L)混合，25℃保溫10min后，加入0.1mL 25℃預(yù)熱的6mmol/L鄰苯三酚，迅速搖勻，于波長(zhǎng)320nm處每隔30s測(cè)定吸光度，按照下式計(jì)算超氧陰離子自由基清除率。

式中：Ac為鄰苯三酚自氧化速率，即每分鐘增加的吸光度；As為加入樣品后，每分鐘增加的吸光度。

1.3.7羥自由基清除能力的測(cè)定

參照Lee等[14]的方法。0.1mL待測(cè)液與1mL反應(yīng)緩沖液混合(含0.1mmol/L FeCl3，0.104mmol/L EDTA，1.5mmol/L H2O2，2.5mmol/L脫氧核糖，0.1mmol/L 抗壞血酸，pH7.4)，37℃水浴保溫1h后，加入1mL 2.8% TCA溶液和1mL 0.5% TBA(0.025mol/L NaOH溶液溶解)，80℃水浴保溫30min。冷卻后，于波長(zhǎng)532nm處測(cè)定吸光度，按下式計(jì)算羥自由基清除率。

式中：Ac為對(duì)照的吸光度，As為樣品的吸光度。

1.3.8ABTS自由基清除能力的測(cè)定

參照Ozgen等[15]的方法并稍加改動(dòng)。7.0mmol/L ABTS·與終濃度為2.45mmol/L的過(guò)硫酸鉀混合，室溫避光放置12～16h。用pH4.5的乙酸鈉溶液(20mmol/L)稀釋至波長(zhǎng)734nm處的吸光度為0.7±0.02。取3mL該溶液與20μL待測(cè)液混合，放置6min，于波長(zhǎng)734nm處測(cè)定吸光度，按照下式計(jì)算ABTS自由基清除率。

式中：Ac為對(duì)照的吸光度；As為樣品的吸光度。

1.4數(shù)據(jù)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Statistix 8.1軟件包中Linear Models程序進(jìn)行，差異顯著性(P＜0.05)分析使用Tukey HSD程序。

2　結(jié)果與分析

2.1黑加侖花色苷提取條件的確定

2.1.1提取溶劑的確定

用不同溶劑以料液比1∶20在35℃提取2h所得的花色苷提取量、還原能力和DPPH自由基清除率見(jiàn)表1。可以看出，乙醇鹽酸溶液為提取溶劑時(shí)，花色苷提取量最高，為175.52mg/100g，還原能力和DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，分別為1.38和74.56%，與其他提取溶劑相比，差異性顯著(P＜0.05)。因此，選擇乙醇鹽酸溶液為提取溶劑。

表1　提取溶劑對(duì)花色苷提取量和抗氧化能力的影響Table 1 Anthocyanin contents and antioxidant activity of different solvent extracts from blackcurrants

2.1.2乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定

圖1　乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花色苷提取量和抗氧化能力的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction rate and antioxidant activity of anthocyanins

由圖1可以看出，用乙醇鹽酸溶液(鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%)以料液比1∶20在35℃提取2h，乙醇體積分?jǐn)?shù)從20%增加到40%時(shí)，提取量從165.64mg/100g顯著增加到177.27mg/100g(P＜0.05)，隨后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，提取量增加緩慢，且不顯著(P＞0.05)，并且當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)80%時(shí)，花色苷提取量略有降低，這與Patil等[16]的研究結(jié)果相似。由于黑加侖中含有部分親水性花色苷，因此沒(méi)有選擇100%乙醇提取。DPPH自由基清除率和還原能力在乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%和80%時(shí)較低，乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%時(shí)較高，但相互之間差異不顯著(P＞0.05)。若乙醇體積分?jǐn)?shù)較高，則提取物不適合作為食品著色劑[16]。綜合考慮，選擇40%乙醇進(jìn)行提取較好。

2.1.3料液比的確定

以40%乙醇鹽酸溶液(鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%)為提取溶劑，用不同料液比于35℃提取2h所得的花色苷提取量、還原能力和DPPH自由基清除率見(jiàn)圖2，料液比為1∶5時(shí)，花色苷提取量最低，為154.14mg/100g，料液比為1∶10時(shí)，顯著增加到179.55mg/100g(P＜0.05)，料液比為1∶30時(shí)，提取量達(dá)到最高為189.83mg/100g。還原能力和DPPH自由基清除能力變化趨勢(shì)相似，料液比為1∶5時(shí)二者均最低，分別為0.87和56.50%，料液比減小到1∶10時(shí)，分別顯著增加到1.05和62.44%(P＜0.05)，隨后隨著料液比的減小，二者均增加不顯著(P＞0.05)。綜合以上情況，為了節(jié)省提取溶劑以及縮短濃縮時(shí)間，選擇料液比為1∶10進(jìn)行提取。

圖2　料液比對(duì)花色苷提取量和抗氧化能力的影響Fig.2 Effect of material/liquid ratio on extraction rate and antioxidant activity of anthocyanins

2.1.4提取時(shí)間的確定

以40%乙醇鹽酸溶液(鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%)為提取溶劑，在料液比1∶10的條件下于35℃提取不同時(shí)間所得的花色苷提取量、還原能力和DPPH自由基清除率見(jiàn)圖3，可以看出，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，花色苷提取量先增加后降低，2h時(shí)達(dá)到最高，為170.44mg/100g。提取時(shí)間延長(zhǎng)，提取量降低，可能是由于花色苷本身不穩(wěn)定，提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)花色苷造成破壞。DPPH自由基清除率也是在提取時(shí)間為2h時(shí)達(dá)到最高，為65.18%，但清除率整體趨勢(shì)變化緩慢。還原能力也隨著提取時(shí)間先增加后降低，在4h時(shí)達(dá)到最大值1.62，但是與2h相比，差異不顯著(P＜0.05)。由于4h時(shí)的花色苷提取量較低，因此選擇提取時(shí)間為2h。

圖3　提取時(shí)間對(duì)花色苷提取量和抗氧化能力的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate and antioxidant activity of anthocyanins

2.1.5鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定

分別以0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%的鹽酸與40%乙醇溶液混合作為提取溶劑，以料液比1∶10于35℃提取2h所得的花色苷提取量和抗氧化效果如圖4所示，鹽酸對(duì)花色苷提取量的影響差異性不顯著(P＞0.05)。DPPH自由基清除能力隨著鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而逐漸增加，鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%時(shí)，清除率最低，為62.07%，與其他質(zhì)量分?jǐn)?shù)的清除率相比，差異性顯著(P＜0.05)；鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%時(shí)，清除率為71.64%，與1%和1.5%時(shí)的清除率相比，差異性不顯著(P＞0.05)；鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%時(shí)，清除率最高，為77.30%。還原能力隨著pH值的增加，先增加后降低，鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%時(shí)，還原能力最強(qiáng)，但與0.5%和1%時(shí)相比，差異不顯著(P＞0.05)。綜合考慮花色苷提取量、DPPH自由基清除率和還原能力，選擇鹽酸為0.5%進(jìn)行提取，此時(shí)的花色苷提取量為172.29mg/100g，DPPH自由基清除率為71.64%，還原能力為1.64。

圖4　鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)花色苷提取量和抗氧化能力的影響Fig.4 Effect of HCl concentration on extraction rate and antioxidant activity of anthocyanins

2.2黑加侖花色苷的抗氧化性

花色苷含量為0.01%的提取液與質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01% BHA和抗壞血酸兩種抗氧化劑的抗氧化能力比較見(jiàn)表2，可以看出，提取物的還原能力、超氧陰離子自由基清除率、ABTS自由基清除率顯著高于抗壞血酸和BHA(P＜0.05)，而抗壞血酸和BHA二者之間差異不顯著(P＞0.05)；提取物的羥自由基清除率顯著高于抗壞血酸(P＜0.05)，但與BHA差異不顯著(P＜0.05)；提取物的DPPH自由基清除率顯著高于BHA和抗壞血酸(P＜0.05)，抗壞血酸的DPPH自由基清除率顯著高于BHA(P＜0.05)。由以上結(jié)果可以看出黑加侖花色苷提取物的抗氧化效果明顯高于BHA和抗壞血酸。

表2　黑加侖提取物與抗壞血酸、BHA抗氧化能力的比較Table 2 Comparison of antioxidant activities among blackcurrant anthocyanins, ascorbic acid and BHA

3　討論與結(jié)論

由于花色苷是極性分子，因此常用乙醇、甲醇或丙酮做為提取溶劑[17]。Bridgers等[18]以甲醇、酸化甲醇、乙醇和酸化乙醇提取紫紅薯中的花色苷時(shí)發(fā)現(xiàn)，酸化甲醇的提取效果最好。Awika等[19]用丙酮和酸化甲醇對(duì)黑高粱花色苷進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)酸化甲醇的提取效果優(yōu)于丙酮，經(jīng)過(guò)反相高效液相色譜分析，丙酮提取的花色苷分子的結(jié)構(gòu)被修飾，因此丙酮不適合提取高粱屬的花色苷。盡管很多報(bào)道表明甲醇的提取效果最好，但是考慮到甲醇的毒性，選擇乙醇為提取溶劑。此外，花色苷在中性或堿性條件下不穩(wěn)定，通常采用酸化的有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，而且已有研究證實(shí)了酸化有機(jī)溶劑的提取效果優(yōu)于單獨(dú)使用有機(jī)溶劑的提取效果，本研究選擇檸檬酸、乙酸和鹽酸進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)。

在確定乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，花色苷提取量增加緩慢，乙醇為80%時(shí)，花色苷提取量略有降低，這與Patil等[16]的研究結(jié)果相似，Patil在提取紅蘿卜花色苷時(shí)，發(fā)現(xiàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)從20%增加到80%的過(guò)程中，花色苷提取量先增加，在50%達(dá)到最大值，隨后花色苷提取量降低。Vatai等[20]用50%、70%、100%丙酮提取葡萄殘?jiān)谢ㄉ?，發(fā)現(xiàn)丙酮濃度為50%時(shí)，花色苷提取量最高。這可能是由于有機(jī)溶劑濃度增加降低了親水性花色苷的提取率，從而導(dǎo)致了總花色苷提取量降低。

Revilla等[21]在提取紅葡萄花色苷時(shí)發(fā)現(xiàn)，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于1%的鹽酸進(jìn)行提取時(shí)，非乙?；ㄉ蘸拖愣辊；ㄉ盏暮吭黾?，但會(huì)導(dǎo)致乙酰化花色苷糖基部分水解，含量降低，因此盡管總花色苷含量增加，但為了防止乙?；ㄉ账猓矐?yīng)避免使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于1%的鹽酸。這也是本實(shí)驗(yàn)選擇0.5%鹽酸進(jìn)行提取的原因。

Koponen等[3]用甲醇鹽酸提取黑加侖花色苷，鮮果花色苷提取量為201mg/100g，但并未對(duì)提取液的抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定。由于本實(shí)驗(yàn)選用的是黑加侖凍果，因此略低于該提取量。

將0.01%的黑加侖花色苷與相同質(zhì)量濃度的BHA、抗壞血酸進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)花色苷提取物具有較高的抗氧化能力，除了羥自由基清除能力略低于BHA以外，其他抗氧化指標(biāo)均高于BHA和抗壞血酸，說(shuō)明黑加侖花色苷是一種理想的抗氧化劑。

通過(guò)單因素試驗(yàn)確定黑加侖花色苷最佳提取工藝為提取溶劑乙醇鹽酸溶液、其中乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、提取料液比1∶10(g/mL)、提取時(shí)間2h，所得提取液的花色苷質(zhì)量濃度86.15mg/L，即提取量172.29mg/100g，此時(shí)提取液的DPPH自由基清除率為71.64%，還原能力為1.64；花色苷質(zhì)量濃度0.1mg/mL的提取液較同質(zhì)量濃度的BHA和抗壞血酸具有更高的還原能力和自由基清除能力(P＜0.05)。這些研究結(jié)果表明，黑加侖果實(shí)中花色苷含量豐富且具有較強(qiáng)的抗氧化能力，作為一種天然抗氧化劑，黑加侖花色苷具有良好的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。

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Extraction and Antioxidant Activity of Anthocyanins from Blackcurrants

JIA Na，KONG Bao-hua*，ZHANG Hong-tao
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

In order to optimize the extraction of anthocyanins from blackcurrants, the effects of solvent type, ethanol concentration, material/liquid ratio, extraction time, HCl concentration on the extraction yield of anthocyanins and the DPPH free radical scavenging rate and reducing power of blackcurrant extracts were explored. Extraction for 2 h at a material/liquid ratio of 1∶10 (g/mL) using acidified aqueous ethanol (containing 40% ethanol and 0.5% HCl) as the extraction solvent provided optimum extraction of anthocyanins from blackcurrants. The resultant extraction yield of anthocyanins and the anthocyanin content, DPPH free radical scavenging rate and reducing power of the obtained blackcurrant extract were 172.29 mg/100 g of fruit, 86.15 mg/L, 71.64% and 1.64 (A700), respectively. Blackcurrant anthocyanins at the concentration of 0.1 mg/mL revealed stronger DPPH free radical scavenging rate and reducing power than BHA and ascorbic acid of the same concentration (P ＜ 0.05). Thus, blackcurrant, rich in highly antioxidant anthocyanins, has a promising prospect for development and application.

blackcurrant；anthocyanins；extraction；antioxidant activity

TS202.3

A

1002-6630(2011)16-0162-05

2010-11-12

國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(200903012-02)

賈娜(1982—)，女，博士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程。E-mail：jiana_2010@163.com

*通信作者：孔保華(1963—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工。E-mail：kongbh@163.com