陳言峰,馬文山,陳文慧,梁日深,廖富蘋,鄒記興

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,廣東廣州510642)

斑鱧嗜水氣單胞菌病病原的鑒定及其病理組織學(xué)的研究

陳言峰,馬文山,陳文慧,梁日深,廖富蘋,鄒記興

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,廣東廣州510642)

從患病斑鱧Channa maculata體內(nèi)分離到一株細(xì)菌(FS20100810),經(jīng)人工感染試驗(yàn)證實(shí)為該病的病原菌。該菌株兼性厭氧,為革蘭氏陰性桿菌,能運(yùn)動,無芽孢,無莢膜,能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、七葉苷,氧化酶反應(yīng)、接觸酶反應(yīng)、吲哚試驗(yàn)和M.R.試驗(yàn)均為陽性。該菌株對斑鱧的半致死濃度為6.83×105cfu/mL。16S rRNA基因序列與嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila的同源性為99.6%。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,該菌株對氧氟沙星、菌必治、先鋒噻肟等抗生素敏感,對復(fù)方新諾明等中度敏感,對苯唑青霉素、青霉素G、氨芐青霉素耐藥。通過對人工感染的斑鱧進(jìn)行組織切片觀察,發(fā)現(xiàn)病魚的鰓、心肌、肝臟、腎臟、脾臟、腸道等器官組織均有明顯的病理變化。

斑鱧;嗜水氣單胞菌;16S rRNA;毒力因子;組織病理

斑鱧Channa maculata屬于鱸形目、攀鱸亞目、鱧科、鱧屬,俗稱黑魚、蛇頭魚、生魚。斑鱧是一種肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高的淡水經(jīng)濟(jì)魚類。自然界的斑鱧對不良水溫、水質(zhì)及缺氧有較強(qiáng)的耐受力,很少發(fā)病。但隨著現(xiàn)代集約化高密度養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大,斑鱧的病害較為嚴(yán)重。本試驗(yàn)中,筆者從廣東佛山市某斑鱧養(yǎng)殖場患病斑鱧體內(nèi)分離到一株致病菌,通過鑒定,確定該致病菌為嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila,并對該菌株的致病力、毒力因子及患病斑鱧的組織病理學(xué)進(jìn)行了研究,旨在為斑鱧養(yǎng)殖中病害的防治提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

患病斑鱧取自廣東佛山市某斑鱧養(yǎng)殖場,癥狀為:患病部位出現(xiàn)圓形、橢圓形的紅斑,病灶中間的鱗片脫落,壞死的表皮腐爛,形成潰瘍,嚴(yán)重時甚至露出骨骼或內(nèi)臟。健康的斑鱧購于廣州市黃沙水產(chǎn)市場,體質(zhì)量為(531±44)g。生化鑒定用微量生化管和羊血瓊脂平板均購于廣州環(huán)凱微生物有限公司?？股丶埰徲诤贾萏旌臀⑸镌噭┯邢薰?。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購于廣州東盛生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化 采用無菌操作對病原菌進(jìn)行分離純化。從發(fā)病瀕死的斑鱧肝、腎、體表潰爛處取樣,劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上, 37℃下培養(yǎng)24～48 h后,挑取占優(yōu)勢、形態(tài)一致的單個菌落進(jìn)行純培養(yǎng),得到一株細(xì)菌FS20100810。

1.2.2 菌株FS20100810的生理、生化鑒定 挑取新鮮菌落接種于營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)18 h,取80 μL的肉湯培養(yǎng)物加入各微量生化管中,37℃下培養(yǎng)8～24 h,觀察結(jié)果。

1.2.3 菌株FS20100810 16S rRNA基因序列的測定 用細(xì)菌的通用引物擴(kuò)增16S rRNA,P1:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;P2:5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。引物由上海英駿生物技

術(shù)有限公司合成。50 μL的PCR反應(yīng)體系中含有: 5 μL 10×PCR緩沖液(含Mg2+),2 μL 10 mmol/L 4×dNTP,各1 μL 10 mmol/L正向和反向引物,2 μL TaqDNA聚合酶(1 U/μL),2 μL模板,37 μL雙蒸餾水。PCR反應(yīng)條件為:94℃下預(yù)變性5 min;94℃下變性30 s,58℃下退火45 s,72℃下延伸1 min 30 s,共進(jìn)行30個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測,用PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化后,送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。將所得序列與GenBank中的核酸序列進(jìn)行Blast,用Clustal X和Mega軟件進(jìn)行同源性比較。

1.2.4 人工感染試驗(yàn) 將菌株FS20100810接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上,37℃下培養(yǎng)24 h,將其菌落用無菌生理鹽水洗脫,制成菌懸液,分別稀釋至濃度為2.72×108、2.72×107、2.72×106、2.72×105、2.72×104cfu/mL。以上每個濃度的菌懸液,按0.5 mL/尾的劑量分別腹腔注射10尾健康斑鱧,作為感染組。對照組的斑鱧按照0.5 mL/尾的劑量腹腔注射無菌的NaCl(15 g/L)溶液。連續(xù)觀察15 d,記錄魚的發(fā)病癥狀及死亡情況,并對死亡魚進(jìn)行細(xì)菌再分離。另取10尾健康斑鱧,按1 mL/尾的劑量腹腔注射濃度為2.72×108cfu/mL的菌液,取瀕死魚的組織固定。

1.2.5 菌株FS20100810毒力因子的檢測

1)溶血活性的測定。挑取新鮮菌落劃線接種于體積分?jǐn)?shù)為5%的羊血瓊脂平板上,于30℃下培養(yǎng)48 h,觀察結(jié)果。菌落周圍出現(xiàn)溶血圈者,判定為溶血陽性。

2)胞外蛋白酶的檢測。挑取新鮮菌落劃線接種于10 g/L的脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂平板上, 28℃下培養(yǎng)24 h,在菌落周圍出現(xiàn)清晰的溶蛋白圈者,判為陽性[1]。

3)脂酶的檢測。挑取新鮮菌落劃線接種于吐溫80瓊脂平板上,30℃下培養(yǎng)48 h,在菌落周圍出現(xiàn)模糊的暈圈者,判為陽性[2]。

4)卵磷脂酶的檢測。挑取新鮮菌落劃線接種于卵黃瓊脂平板上,30℃下培養(yǎng)48 h,在菌落周圍出現(xiàn)不透明的區(qū)帶者,判為陽性[2]。

1.2.6 菌株FS20100810溶血素基因和氣溶素基因的PCR擴(kuò)增 比較分析已登錄GenBank的氣單胞菌屬的溶血素基因,根據(jù)這些序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物為

比較分析已登錄GenBank的氣單胞菌屬的氣溶素基因,根據(jù)這些序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物為

引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測,用PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化后,送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。將所得序列與GenBank中的核酸序列進(jìn)行Blast,用Clustal X和Mega軟件進(jìn)行同源性比較。

1.2.7 藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行。將該菌的24 h培養(yǎng)物用無菌生理鹽水洗下制成1.5×108cfu/mL的菌懸液,取80 μL菌懸液涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上,用無菌鑷子將抗生素紙片貼在瓊脂表面,于37℃下恒溫培養(yǎng)48 h,記錄抑菌圈的直徑。

1.2.8 病理組織學(xué)觀察 取人工感染后瀕死的魚6尾和健康的魚3尾,分別取心、肝、腎、脾、鰓、腸,用體積分?jǐn)?shù)為10%的中性福爾馬林固定,石蠟包埋,切片,H.E染色,光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)特征

觀察發(fā)現(xiàn),在LB平板培養(yǎng)基上形成的菌落邊緣整齊,表面濕潤,隆起、光滑,半透明,顏色為灰白色至淡黃色,直徑為1～2 mm。將該菌在營養(yǎng)肉湯(28℃)中培養(yǎng)24 h,其生長良好,呈均勻混濁。

2.2 生理生化鑒定

從表1可見,根據(jù)FS20100810的生理、生化特性的檢測結(jié)果,鑒定該菌為嗜水氣單胞菌[2]。

2.3 FS20100810的16S rRNA基因序列的測定

菌株FS20100810所擴(kuò)增的16S rRNA基因序列長度為1 406 bp(圖1),將該序列(Accession No. HQ529494)與GenBank中的序列進(jìn)行比較,結(jié)果與嗜水氣單胞菌同源性達(dá)99.6%,鑒定該菌應(yīng)為嗜水氣單胞菌。

2.4 人工感染試驗(yàn)

從人工感染后死亡的斑鱧體內(nèi)能重新分離到原

感染細(xì)菌,表明菌株FS20100810即為該病的病原菌。根據(jù)改進(jìn)的寇氏法[3],計(jì)算菌株FS20100810對斑鱧的半致死濃度LC50為6.83×105cfu/mL。

表1 FS20100810的生理生化特征Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of FS20100810

圖1 FS20100810 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCRamplificationof 16SrRNAgeneof FS20100810

2.5 FS20100810毒力因子的檢測

從圖2可見,菌株FS20100810在血液瓊脂平板上產(chǎn)生β溶血,并產(chǎn)生胞外蛋白酶、酯酶和卵磷脂酶等毒力因子。

圖2 FS20100810毒力因子的檢測結(jié)果Fig.2 Detection of virulence factors of FS20100810

2.6 采用PCR擴(kuò)增FS20100810溶血素基因和氣溶素基因

從圖3可見:用FS20100810溶血素基因擴(kuò)增出355 bp大小的片段(Accession No.JF298810),將該序列與GenBank中的序列進(jìn)行比對,結(jié)果與嗜水氣單胞菌溶血素基因序列的同源性為98.7%。

從圖4可見:用FS20100810氣溶素基因擴(kuò)增出331 bp大小的片段(Accession No.JF298811),將該序列與GenBank中的序列進(jìn)行比對,結(jié)果與嗜水氣單胞菌氣溶素基因序列的同源性為92.8%。

圖3 用PCR擴(kuò)增FS20100810的溶血素基因Fig.3 PCR amplification of hemolysin gene of FS20100810

圖4 用PCR擴(kuò)增FS20100810的氣溶素基因Fig.4 PCRamplificationofaerolysingeneof FS20100810

2.7 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,FS20100810對氧氟沙星、菌必治、先鋒噻肟等抗生素敏感,對復(fù)方新諾明等多種抗生素為中度敏感,對苯唑青霉素、青霉素G、氨芐青霉素、利福平有耐藥性(表2)。

表2 FS20100810對23種抗生素藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Sensibility of FS20100810 to 23 types of antibiotics

2.8 病理組織學(xué)觀察

對照組魚的組織學(xué)觀察結(jié)果見圖5-A、C、E、G、I、K。試驗(yàn)組魚的病理組織學(xué)觀察結(jié)果表明:肝細(xì)胞絕大部分壞死消失,只剩下肝組織結(jié)構(gòu)的網(wǎng)狀支架和細(xì)胞碎片,形成大小不等的空泡,溶解、消失的細(xì)胞相互融合,形成結(jié)構(gòu)紊亂的壞死灶,并形成大量淤血(圖5-B);脾組織變性壞死,溶解,形成結(jié)構(gòu)紊亂的壞死灶(圖5-D);腎小囊腔擴(kuò)張,腎間質(zhì)出血,大量紅細(xì)胞浸潤,腎小球擴(kuò)張、充血,部分腎間質(zhì)變性壞死(圖5-F);鰓小

片基底部水腫,間隙變寬,上皮細(xì)胞與支持細(xì)胞分離,其間形成空腔,部分上皮細(xì)胞壞死、脫落(圖5-H);心肌出血,心肌纖維間可見大量的紅細(xì)胞,有的心肌纖維形成較大空隙,部分心肌纖維

變性壞死(圖5-J);腸黏膜上皮層廣泛性壞死脫落,基底膜排列紊亂,毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血(圖5 -L)。

圖5 對照組和試驗(yàn)組斑鱧正常及病理組織學(xué)的觀察(×400)Fig.5 Pathohistological observation of liver,spleen and kidney(×400)of the snakehead in the experimental groups and in the control group

3 討論

本研究中,菌株FS20100810的16S rRNA、溶血素、氣溶素這三個基因的序列與GenBank中已知嗜水氣單胞菌相應(yīng)序列的同源性分別在99.6%、98.7%和92.8%以上。檢測致病性嗜水氣單胞菌有幾項(xiàng)關(guān)鍵的生化指標(biāo),如氧化酶試驗(yàn)呈陽性,能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七葉苷和水楊苷[4]。盡管菌株FS20100810的阿拉伯糖為陰性和棉籽糖為陽性,不符合嗜水氣單胞菌的特性,但綜合生理生化與分子鑒定結(jié)果,可判定本試驗(yàn)中所分離的菌株為嗜水氣單胞菌。

嗜水氣單胞菌廣泛存在于淡水、土壤和水生動物中,寄主范圍廣,是一種典型的人、獸、魚共患病病原,可引起多種水產(chǎn)動物病害[5-7],從而給淡水養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)計(jì)算,菌株FS20100810對斑鱧半致死濃度為6.83×105cfu/mL,依據(jù)魚類致病菌的劃分標(biāo)準(zhǔn)[8],此菌株對斑鱧具有較強(qiáng)的致病力,這與陳昌福等[9]的研究結(jié)果基本一致。該菌對鱧科其它魚類是否也有較強(qiáng)的致病性,有待進(jìn)一步研究。

溶血素是一種外毒素,可以參與細(xì)菌和宿主細(xì)胞的黏附及定植過程,也是嗜水氣單胞菌的重要致病因子[10-12]。本研究中的溶血素用平板法檢測的結(jié)果與用PCR檢測的結(jié)果一致。

氣溶素具有溶血性、細(xì)胞毒性和腸毒性,是嗜水氣單胞菌主要的毒力因子之一[13-16]。本研究中,經(jīng)PCR擴(kuò)增出331 bp的片段,從分子水平上證明菌株FS20100810含有氣溶素基因,并具有一定的致病性。

胞外蛋白酶是嗜水氣單胞菌重要的毒力因子。嗜水氣單胞菌能產(chǎn)生多種蛋白酶,如絲氨酸蛋白酶、彈性蛋白酶、酪素水解酶、明膠水解酶等,均能降解脫脂奶,在脫脂奶平板上產(chǎn)生溶蛋白圈。

脂酶是嗜水氣單胞菌胞外酶的一種。有資料表明,脂酶有可能通過與動物的白細(xì)胞相互作用,或通過脂肪分解產(chǎn)生的脂肪酸影響免疫系統(tǒng)功能,從而構(gòu)成毒力因子[17]。

卵磷脂酶作為重要的毒力因子,在宿主細(xì)胞內(nèi)的存活、細(xì)胞溶解、細(xì)胞間的擴(kuò)散中起著重要作用[18]。鑒于平板法的局限性,推測嗜水氣單胞菌可能產(chǎn)生卵磷脂酶,是否屬實(shí),還有待于進(jìn)一步研究。

本研究中,作者僅通過選擇性培養(yǎng)基對嗜水氣單胞菌FS20100810的胞外蛋白酶、酯酶和卵磷脂酶進(jìn)行了初步的檢測。

菌株FS20100810對23種抗生素敏感性的測定結(jié)果,可為今后對由嗜水氣單胞菌引起的斑鱧感染癥防治用藥提供參考?？紤]到菌株間差異性,提議進(jìn)行藥敏測定時應(yīng)盡可能地對不同病例、不同病魚的分離菌株進(jìn)行測定以選擇其確實(shí)有規(guī)律性的敏感藥物。

人工感染后的病理組織學(xué)變化以廣泛的組織細(xì)胞變性、壞死為主,其中肝、腸和心肌的病變與杜雄偉等[19]報(bào)道的嗜水氣單胞菌感染劍尾魚后組織病理變化基本一致。本研究中,菌株FS20100810感染對斑鱧脾臟的損害程度很大,與宋鐵英等[20]報(bào)道的嗜水氣單胞菌感染鰻鱺后脾臟病理變化較為輕微不一致。這可能是由于試驗(yàn)中所用的菌液濃度、攻毒劑量、取病料的時間不同所致。該菌對鰓的損害程度相對較小,推測可能是由于本研究中采用腹腔注射的感染方式,細(xì)菌在進(jìn)入斑鱧體內(nèi)后,首先侵入脾、肝、腎等組織器官,形成炎癥,引起細(xì)胞實(shí)質(zhì)性的變性壞死,鰓組織病變尚未加深時,病魚已因肝、腎、脾功能發(fā)生嚴(yán)重障礙而死亡。

[1] 王春林,曹雪,劉曉丹,等.嗜水氣單胞菌不同分離株生化特性及胞外蛋白酶的檢測[J].畜牧與獸醫(yī),2008,40(6):16-19.

[2] 東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京:科學(xué)出版社,2001.

[3] 楊茂成.獸醫(yī)統(tǒng)計(jì)學(xué)[M].北京:中國展望出版社,1990.

[4] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T 1865222002致病性嗜水氣單胞菌檢驗(yàn)方法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2002.

[5] 潘厚軍,吳淑勤,董傳甫,等.鱖致病性嗜水氣單胞菌GYK1株的鑒定、毒力及溶血性[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,13(1): 24-29.

[6] 劉加波,謝芝勛,鄧顯文,等.羅非魚嗜水氣單胞菌的分離鑒定[J].水利漁業(yè),2006,26(4):100-103.

[7] Kirov S M,Hudson J A,Hayward L J,et al.Distribution of Aeromonas hydrophila hybridization groups and their virulence properties in Australasian clinical and environmental strains[J].Letters in Applied Microbiology,1994,18:71-73.

[8] Devesa S,Toranzo A E,Barja J L.Fish report of vibriosis in turbot (Scophthulnus maximus)cultured in northwestern Spain.AE Ellis [M]//Fish and Shellfish Pathology.London:Academic Press, 1985:131-140.

[9] 陳昌福,劉毅.斑鱧細(xì)菌性敗血癥病原菌的分離與鑒定[J].中

國獸醫(yī)學(xué)報(bào),1998,18(2):144-146.

[10] Hirono I,Aoki T.Nucleotide sequence and expression of an extracellular hemolysin gene of Aeromonas hydrophila[J].Microbial Pathogenesis,1991,11(3):189-197.

[11] Asao T,Kinoshita Y,Kozaki S,et al.Purification and some properties of Aeromonas hydrophila hemolysin[J].Infection and Immunity,1984,46:122-127.

[12] Asao T,Kozaki S,Kato K,et al.Purification and characterization of an Aeromonas hydrophila hemolysin[J].J Clinical Microbiol, 1986,24:228-232.

[13] 盧強(qiáng),李連瑞,付寶權(quán),等.致病性嗜水氣單胞菌氣溶素基因的克隆與高效表達(dá)[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2004,24(1):21-23.

[14] Parker M W,Buckley J T,Postma J P,et al.Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin in its water-soluble and membranechannel states[J].Nature,1994,367:19-28.

[15] Hardie K R,Schulze A,Parker M W,et al.Vibrio spp.secrete proaerolysin as a folded dimmer without the need for disulphide bond formation[J].Mol Microbiolp,1995,17(6):1035-1044.

[16] 陳懷青.嗜水氣單胞菌外毒素研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué):微生物分冊,1992,15(4):256-259.

[17] Eftimiadi C,Buzzi E,Tonetti M,et al.Short-chain fatty acids produced by anaerobic bacteria alter the physiological responses of human neutrophils to chemotactic peptides[J].Journal of Infection, 1987,14:43-53.

[18] Titball R W.Bacterial phospholipases C[J].Microbiol Rev, 1993,57:347-366.

[19] 杜雄偉,常藕琴,王曉輝,等.嗜水氣單胞菌對劍尾魚的致病性及組織病理學(xué)研究[J].長江大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2005,2 (2):53-56.

[20] 宋鐵英,龔暉,Khomyakova T I,等.嗜水氣單胞菌ZN1攻擊鰻鱺后的組織病理觀察[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2008,23(1):25-30.

Histopathology and identification of pathogen Aeromonas hydrophila in diseased snakehead Channa maculata

CHEN Yan-feng,MA Wen-shan,CHEN Wen-hui,LIANG Ri-shen,LIAO Fu-pin,ZOU Ji-xing
(College of Animal Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

A pathogen(FS20100810)was isolated from ulcered snakehead,Channa maculata,which was proved to be the pathogenic bacterium of the disease by re-infection experiments.The strain was found to be gram negative, anaerobic,bacilliform in shape and motile.It had no capsule and gemma,and utilized glucoses,sucrose,maltose, mannitol,esculin as energy and its oxidase reaction,catalase reaction,indole and M.R.test were positive.The half lethal concentration value for the strain to the snakehead was 6.83×105cfu/mL.Homology analysis showed that it had the high similarity to Aeromonas hydrophila with 99.6%similarity.The drug sensitivity showed the strain was sensitive to ofloxacin,ceftriaxone,and Cefotamine was intermediately sensitive to complex sinomin and was resistant to oxazocilline,penicillin G and ampicillin.There were obvious pathological changes in the tissues of the gills,cardiac muscles,livers,kidneys,spleens and intestines in the snakeheads challenged by strain FS20100810 by pathohistological observation.

Channa maculata;Aeromonas hydrophila;16S rRNA;histopathology;virulence factor

S941.42

A

2095-1388(2011)06-0514-07

2011-01-05

國家星火計(jì)劃項(xiàng)目(2008GA780002);廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目(2011B090400270);清遠(yuǎn)市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011C011106009)

陳言峰(1981-),男,博士研究生。E-mail:chyfwf@126.com

鄒記興(1966-),男,教授,博士生導(dǎo)師。E-mail:zoujixing@163.com