傅潤澤,劉俊榮,王帥,汪濤,辛草

(大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧大連116023)

采用酸堿提取法對鰱肌肉蛋白分離特性的影響

傅潤澤,劉俊榮,王帥,汪濤,辛草

(大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧大連116023)

對酸處理和堿處理過程中鰱肌肉蛋白質(zhì)的分離特性,包括蛋白質(zhì)溶解度、回收率和勻漿黏度等進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明:當(dāng)pH為1.5～12.5時(shí),普通肉溶解蛋白(Solution ordinary muscle protein,SMP-1)與血合肉溶解蛋白(Solution dark muscle protein,SMP-2)溶解度的變化規(guī)律無明顯差別,酸處理的最大溶解度均在pH為2.5下,堿處理的最大溶解度均在pH為11.5～12.5下,兩者等電點(diǎn)均在pH為5.5下;普通肉勻漿(Ordinary muscle homogenate,OMH)和血合肉勻漿(Dark muscle homogenate,DMH)的黏度均隨溶解度的增加而增加,但OMH黏度要高于DMH;采用酸堿處理法的蛋白質(zhì)回收率都非常高,IMP-1最高能達(dá)到90.5%,IMP-2也能達(dá)到89.5%。

鰱;血合肉;普通肉;分離蛋白;等電點(diǎn)

隨著中國漁業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展,經(jīng)濟(jì)魚類逐年減少,但低值魚產(chǎn)量卻逐年增多。這些低值魚類由于價(jià)格低,加工和回收手段落后,造成大量營養(yǎng)成分流失,資源浪費(fèi)嚴(yán)重且污染了環(huán)境[1]。目前低值魚蛋白主要加工利用途徑有魚糜、魚粉、液體魚蛋白和濃縮魚蛋白等[2],其中魚粉與魚糜制品是經(jīng)典的低值魚蛋白的有效利用途徑,但二者都有一定的局限性。魚粉的局限性在于其功能性差,只能用作飼料,飼用魚蛋白需再經(jīng)生物鏈轉(zhuǎn)換后方可供人類利用;魚糜技術(shù)的局限性在于對原料蛋白質(zhì)性質(zhì)的苛刻要求制約了很大一部分變性魚蛋白的利用。另外液體魚蛋白目前也主要用于飼料行業(yè)。功能性濃縮魚蛋白是近年來低值魚研究的重點(diǎn)方向之一,人們不斷探索新的濃縮魚蛋白加工利用方法,開發(fā)出具有功能性的魚蛋白制品[3-5]。

采用酸堿處理(pH-shifting)提取動物蛋白是20世紀(jì)90年代末新興的一種技術(shù),該方法是利用蛋白質(zhì)在不同pH下溶解度不同的原理,先在極端條件下將絕大部分蛋白質(zhì)溶解,去掉不溶解物,再調(diào)pH至蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)沉淀回收[6]。將此方法用于魚肌肉分離蛋白的制備能顯著提高產(chǎn)率,使廢水中蛋白質(zhì)的含量大大降低,從而減少了廢水處理成本[7-8]。此外,前期研究發(fā)現(xiàn),在功能性方面用該方法分離的魚蛋白也有明顯的優(yōu)勢[9]。

鰱為中國淡水養(yǎng)殖四大魚類之一,雖然易飼養(yǎng)、生長快、成本低,但其肉薄、魚刺多,風(fēng)味不及其它淡水魚,在市場上不很受歡迎,是典型的低值水產(chǎn)品。本研究中,作者采用酸堿處理法分別對鰱普通肉和血合肉進(jìn)行加工處理,得到普通肉分離蛋白(Isolated ordinary muscle protein,IMP-1)和血合肉分離蛋白(Isolated dark muscle protein,IMP -2),并對處理過程中所表現(xiàn)出來的鰱肌肉蛋白質(zhì)的分離特性,以及蛋白質(zhì)的溶解度、回收率和黏度等進(jìn)行比較研究,旨在為進(jìn)一步探索低值魚加工的新工藝、新方法提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

試驗(yàn)儀器有:DS21型高速勻漿機(jī)(上海樣品模型廠生產(chǎn));GL-21M高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司生產(chǎn));PHS—3C型pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn));721型分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司生產(chǎn));電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療機(jī)械廠生產(chǎn)); NDJ—8S型數(shù)字黏度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公

司生產(chǎn));GH型魚肉脫骨機(jī)(深圳市奇華達(dá)實(shí)業(yè)有限公司制造生產(chǎn));分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司生產(chǎn))。

1.2 原料及處理

鮮活鰱購自大連市長興水產(chǎn)品市場,平均體質(zhì)量為0.8 kg。將鰱解剖,剪去鰭和尾,刮鱗后去頭、去內(nèi)臟,用冰水洗凈后,采用手工刨片,然后用采肉機(jī)采肉,上述操作均在4℃下進(jìn)行。第一次采肉所得魚肉顏色白嫩,絕大多數(shù)為普通肌肉,將此魚肉作為試驗(yàn)用普通肉原料(Ordinary muscle, OM);第二次采肉所得魚肉顏色為暗紅色,絕大多數(shù)為血合肉,將此魚肉作為試驗(yàn)用血合肉原料(Dark muscle,DM)。將兩種魚肉裝入包裝袋真空密封,每袋質(zhì)量均為1 kg,然后將魚肉立即放入冰柜(-20℃)中冷凍保存,以供試驗(yàn)用。

1.3 肌肉蛋白質(zhì)的酸堿溶解處理與回收

1.3.1 魚肉勻漿的準(zhǔn)備 從冰柜中取出普通肉原料或血合肉原料各150 g,4℃下解凍。將解凍后的魚肉與去離子水按質(zhì)量比1∶9混合,并在勻漿機(jī)中以10 000 r/min勻漿30 s(4℃),分別得到普通肉勻漿(Ordinary muscle homogenate,OMH)和血合肉勻漿(Dark muscle homogenate,DMH)。

1.3.2 蛋白質(zhì)的溶解 將普通肉勻漿分為兩份,以0.5 pH為梯度,一份用1 mol/L HCl依次調(diào)節(jié)pH到1.5(酸處理),另一份采用1 mol/L NaOH依次調(diào)節(jié)pH到12.5(堿處理),即得到不同pH值下普通肉的溶解蛋白(Solution ordinary muscle protein,SMP-1)。采用同樣方法處理血合肉,即得到不同pH值下血合肉的溶解蛋白(Solution dark muscle protein,SMP-2)。

1.3.3 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)沉淀 調(diào)節(jié)SMP-1的pH到等電點(diǎn),即得到普通肉分離蛋白(Isolated ordinary muscle protein,IMP-1);采用同樣方法處理SMP-2,即得到血合肉分離蛋白(Isolated dark muscle protein,IMP-2)。

采用酸堿處理法制備分離魚蛋白質(zhì)的流程見圖1。

圖1 采用酸堿處理法制備分離鰱蛋白質(zhì)的流程圖Fig.1 Flowing chart of the acid and alkaline process used in the production of fish muscle protein isolates

1.4 分析測試

1.4.1 蛋白質(zhì)含量的測定 采用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)的含量[10],用721型分光光度計(jì)測定吸光度時(shí),波長為540 nm,測定前加入體積分?jǐn)?shù)為10%的脫氧膽酸以減少因脂質(zhì)的存在而造成的渾濁[11]。

1.4.2 蛋白質(zhì)溶解度的測定 測定鰱SMP-1和SMP-2在pH為1.5～12.5(以0.5為梯度)時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度。計(jì)算公式如下:

蛋白質(zhì)溶解度=(中層清液蛋白質(zhì)濃度×中層清液體積)/(總蛋白質(zhì)濃度×勻漿體積)×100%。

1.4.3 肌肉勻漿黏度的測定 測定鰱OMH和DMH在pH為1.5～12.5(pH的梯度為0.5)時(shí)的黏度,取OMH和DMH各兩份,一份用1 mol/L HCl依次調(diào)節(jié)pH到1.5,另一份用1 mol/L的NaOH依次調(diào)節(jié)pH到12.5,采用NDJ—8S型數(shù)字黏度計(jì)測定每一個(gè)pH下的黏度,轉(zhuǎn)子選取1號轉(zhuǎn)子,轉(zhuǎn)速為60 r/min。

1.4.4 蛋白質(zhì)回收率的測定 測定鰱IMP-1和IMP-2在pH為1.5～12.5(pH的梯度為0.5)時(shí)蛋白質(zhì)的回收率。計(jì)算公式如下:

蛋白質(zhì)回收率=(A-B)/C×100%,

式中:A為第一次離心中層清液中蛋白質(zhì)的含量(mg),A=第一次離心中層清液中蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)×第一次離心中層清液的體積(mL);B為第二次離心上清液中蛋白質(zhì)的含量(mg),B=第二次離心上清液中蛋白質(zhì)的濃度(mg/mL)×第二次離心上清液的體積(mL);C為總蛋白質(zhì)含量(mg),C=總蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)×勻漿體積(mL)。

總蛋白質(zhì)濃度和上清液蛋白質(zhì)濃度的測定方法與蛋白質(zhì)溶解度的測定方法相同。

2 結(jié)果與討論

2.1 酸堿處理過程中鰱肌肉蛋白的溶解特性

蛋白質(zhì)在水中并不是真正溶解而是形成蛋白膠體,蛋白質(zhì)的溶解是蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用以及蛋白質(zhì)與溶劑相互作用的結(jié)果[12]。鰱SMP-1和SMP-2在pH為1.5～12.5時(shí)的溶解度曲線顯示出蛋白質(zhì)溶解度在這一區(qū)間隨pH變化的趨勢(圖2)。當(dāng)pH為5～9時(shí),蛋白質(zhì)之間缺乏靜電斥力,疏水作用增強(qiáng)了蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用,因此溶解度不高;當(dāng)pH為5.5(等電點(diǎn))時(shí),蛋白質(zhì)的溶解度最小;而當(dāng)pH高于10.5和低于4時(shí),蛋白質(zhì)呈現(xiàn)較高的溶解度?？梢哉J(rèn)為,在上述pH條件下,強(qiáng)烈的蛋白質(zhì)分子內(nèi)靜電斥力導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的腫脹和展開,因而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性。強(qiáng)烈的靜電斥力同樣使得蛋白質(zhì)分子之間難以聚合沉淀,因而溶解度比較高[13]。當(dāng)pH為4～5以及pH為9～10.5時(shí),蛋白質(zhì)的溶解度發(fā)生了急劇變化,由接近pI點(diǎn)的10%～20%突然升高到80%～90%。

比較圖2中的兩條曲線可以看出:SMP-1和SMP-2的溶解特性未有明顯差別,SMP-1和SMP -2所表現(xiàn)出的溶解特性均為:pH為2.5時(shí),此時(shí)溶解度最大,可以達(dá)到95%;pH為11.5～12.5時(shí),溶解度能達(dá)到94%左右;pH為5.5時(shí),溶解度小于10%。比較圖2中的酸性區(qū)域和堿性區(qū)域可以看出:pH為1.5～4時(shí),兩種魚肉蛋白的溶解度均呈先增加后減少的趨勢,pH為2.5時(shí)其溶解度最大;而在堿性區(qū)域其溶解度先增加后趨于平衡。pH小于2.5時(shí)溶解度呈下降趨勢的原因是, HCl濃度的上升增加了陰離子強(qiáng)度,從而降低了蛋白分子之間的靜電斥力[14]。

蛋白質(zhì)溶解度曲線的測定,是進(jìn)一步研究的基礎(chǔ)。通過不同pH下的溶解度曲線,可以確定酸堿處理過程中最適的操作參數(shù)。

圖2 鰱普通肉溶解蛋白和血合肉溶解蛋白的溶解度隨pH變化的曲線Fig.2 Protein solubility of soluable ordinary muscle protein(SMP-1)and soluable dark muscle protein(SMP-2)at pH 1.5-12.5

2.2 酸堿處理過程中鰱肌肉勻漿黏度的特性

在酸堿處理過程中,肌肉勻漿的黏度是十分重要的。在一定程度上黏度能反映出肌肉蛋白質(zhì)分子的理化特性和結(jié)構(gòu)的變化。而低黏度是離心分離可溶性蛋白質(zhì)和不溶性物質(zhì)的關(guān)鍵,同時(shí)低黏度也可使脂類物質(zhì)的去除變得更加容易[11]。液體的黏度并不完全取決于蛋白質(zhì)的特性,還受到溫度等試驗(yàn)條件的影響。由于蛋白質(zhì)勻漿液屬于典型的非牛頓性流體,測定的黏度值隨著所受剪切力的變化而變化,因此研究中必須使用同一個(gè)轉(zhuǎn)子以及同種轉(zhuǎn)速進(jìn)行測量。雖然測量的有效量程有限,所得數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性較差,但對于本研究中僅做定性分析來說,依然可以得出較完整的結(jié)論[15]。

從圖3可見,當(dāng)pH為1.5～12.5時(shí),OMH和DMH的黏度曲線均在pH為2.5～3.5以及pH為10.5～11.5時(shí)出現(xiàn)峰值,兩者在酸性和堿性區(qū)間的黏度要明顯大于中性區(qū)域。蛋白質(zhì)溶解度的增加會伴隨黏度的上升,這是因?yàn)殡S著pH的上升或下降,極端pH下的高凈電荷引起的強(qiáng)大分子內(nèi)靜電斥力導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的腫脹和展開,實(shí)際上也導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性。正是由于蛋白質(zhì)在分子構(gòu)象上的改變增加了其流體動力學(xué)體積,引起液體黏度的上升[16]。比較兩種勻漿的黏度曲線可以看出:OMH黏度要高于DMH,這應(yīng)該與兩種魚肉的組成成分不同有關(guān)。與普通肉相比,血合肉中含有更多的水溶性蛋白、糖原、酶類和脂肪[16]。比較圖3中兩條曲線的酸性區(qū)域和堿性區(qū)域可以看出:采用酸處理時(shí)OMH的黏度要高于堿處理下的黏度,而DMH在兩種處理方式下黏度無明顯差別。

圖3 鰱普通肉勻漿和血合肉勻漿的黏度隨pH變化的曲線Fig.3 Viscosityofordinarymusclehomogenate (OMH)anddarkmusclehomogenate (DMH)at pH 1.5-12.5

2.3 等電點(diǎn)處理過程中鰱肌肉蛋白的回收特性

蛋白質(zhì)回收率是評價(jià)肌肉分離蛋白制備工藝水平的一個(gè)重要指標(biāo)。與傳統(tǒng)加工方法相比,采用酸堿處理時(shí),蛋白質(zhì)的回收率要高[17]。從圖4可見:酸處理過程中IMP-1的回收率最高能達(dá)到90.5%, IMP-2能達(dá)到87.5%;堿處理過程中IMP-1和IMP-2回收率都能達(dá)到89.5%。這說明該工藝在魚肌肉分離蛋白的制備方面具有很好的開發(fā)利用潛力。

鰱IMP-1和IMP-2回收率隨pH的變化趨勢均與溶解度的變化規(guī)律一致,即兩種魚肉在酸性區(qū)域和堿性區(qū)域的蛋白回收率明顯要高于中性區(qū)域。比較圖4中的兩條曲線可以看出:pH為1.5～ 12.5時(shí),IMP-1和IMP-2的回收率未有明顯差別,但在酸性區(qū)域IMP-1的回收率略微高于IMP-2。pH為1.5～4.0時(shí),其回收率呈先增加后減少的趨勢,當(dāng)pH為2.5時(shí)其回收率最大;pH大于10.5時(shí),其回收率先增加后趨于平衡。蛋白質(zhì)回收率隨pH變化的曲線圖為采用酸堿處理方法制備魚肌肉分離蛋白提供了參考,若僅考慮盡可能多地回收蛋白質(zhì),采用酸處理方法的最佳pH為2.5,而采用堿處理時(shí)最佳pH為11.5。

雖然蛋白質(zhì)的回收率主要受溶解度的影響,但在實(shí)際處理過程中還受有許多其它因素的影響,如蛋白勻漿中脂類及一些殘留物質(zhì)的影響,勻漿機(jī)和離心機(jī)的轉(zhuǎn)速,以及操作過程中蛋白質(zhì)的損失等[18]。

圖4 鰱普通肉分離蛋白和血合肉分離蛋白的回收率隨pH變化的曲線Fig.4 Recovery of isolated ordinary muscle protein (IMP-1)and isolated dark muscle protein (IMP-2)at pH 1.5-12.5

3 小結(jié)

本研究中探索了用等電點(diǎn)法時(shí)鰱肌肉蛋白的分離特性,對比了堿溶解和酸溶解兩種處理方法對鰱肌肉蛋白分離特性的影響,同時(shí)還對普通肉和血合肉的蛋白分離特性進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示:1)采用酸溶解和堿溶解兩種處理方法對鰱肌肉蛋白的分離特性的影響基本相同,蛋白溶解度、回收率和勻漿黏度等項(xiàng)指標(biāo)變化規(guī)律均未有明顯差別;2)在同種處理?xiàng)l件下,普通肉與血合肉蛋白的溶解特性基本相同,且溶解度越高,回收率和黏度就越高,二者在最大溶解條件下表現(xiàn)出較高的蛋白質(zhì)回收率,普通肉最高能達(dá)到90.5%,血合肉最高能達(dá)到89.5%。總之,本研究結(jié)果表明,等電點(diǎn)法在鰱肌肉蛋白分離方面具有一定的優(yōu)越性,在低值魚

蛋白精深加工方面極具開發(fā)應(yīng)用潛力。此外,酸堿溶解方法、處理?xiàng)l件以及血合肉的存在對鰱肌肉分離蛋白功能特性的影響等還有待進(jìn)一步研究。

[1] 白福玉,鄭華,蔣愛民.低值水產(chǎn)品及水產(chǎn)副產(chǎn)品的加工與綜合利用[J].農(nóng)產(chǎn)品加工,2007(4):76-79.

[2] 佟長青,劉俊榮,周麗敏,等.用魚產(chǎn)品下腳料開發(fā)飼用液體蛋白技術(shù)的研究[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào),2006,21(4):394-396.

[3] 劉俊榮.魚蛋白的綜合利用途徑1——魚粉[J].水產(chǎn)科學(xué), 2000,19(5):37-39.

[4] 劉俊榮.魚蛋白的綜合利用途徑2——酸貯液體魚蛋白[J].水產(chǎn)科學(xué),2000,19(6):36-39.

[5] 劉俊榮.魚肉蛋白質(zhì)組織化方法的研究與應(yīng)用[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào),1998,13(3):72-76.

[6] Nols?e H,Undeland I.The acid and alkaline solubilization process for the isolation of muscle proteins:state of the art[J].Food Bioprocess Technol,2009(2):1-27.

[7] 陳申如,張其標(biāo),倪輝.酸法提取鰱魚魚肉蛋白質(zhì)技術(shù)的研究[J].海洋水產(chǎn)研究,2004,25(5):61-64.

[8] 付湘晉,許時(shí)嬰,王璋,等.酸堿提取鰱魚蛋白功能特性的研究[J].食品工業(yè)科技,2007(4):116-118.

[9] 劉俊榮,汪濤,石泰,等.不同pH條件下羅非魚肌肉蛋白分離效果及其功能特性的研究[J].水產(chǎn)科學(xué),2010,29(6):317-323.

[10] Palafox H,Co’rdova-Murueta J H,Navarrete del Toro M A,et al. Protein isolates from jumbo squid(Dosidicus gigas)by pH-shift processing[J].Process Biochemistry,2009,44:584-587.

[11] Kristinsson H G,Ingadottir B.Recovery and properties of muscle proteins extracted from tilapia light muscle by pH shift processing [J].Food Engineering and Physical Properties,2006,71(3):132 -141.

[12] Damodaran S.Amino acids,peptides,and proteins[M]//Fennema O R.Food Chemistry.New York:Marcel Dekker Inc,1996: 370,389.

[13] Foegeeding E A.Characteristics of edible muscle tissues[M]// Fennema O R.Food Chemistry.New York:Marcel Dekker Inc, 1996:936.

[14] Goto Y,Fink A L.Acid induced folding of heme proteins[J]. Meth Enzymol,1994,232:3-15.

[15] 楊同舟.食品工程原理[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2001:20 -23.

[16] 汪之和.水產(chǎn)品加工與利用[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2002:10-11.

[17] Kristinsson H G,Theodore A E,Demir N,et al.A comparative study between acid and alkali-aided processing and surimi processing for the recovery of proteins from channel catfish muscle [J].Food Chemistry and Toxicology,2005,70(3):298-306.

[18] Kristinsson H G,Liang Y.Effect of pH-shift processing and surimi processing on Atlantic croaker muscle proteins[J].Food Chemistry and Toxicology,2006,17(5):C304-C312.

Effect of isoelectric precipitation processing on isolating properties of fish muscle proteins

FU Run-ze,LIU Jun-rong,WANG Shuai,WANG Tao,XIN Cao
(College of Food Science and Engineering,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

Ordinary muscle and dark muscle of silver carp were prepared using twice mechanical meat separating method,respectively,and soluable ordinary muscle protein(SMP-1)and dark muscle protein(SMP-2)were obtained under critical pH.Isolated ordinary muscle protein(IMP-1)and isolated dark muscle protein(IMP-2) were extracted by isoelectric precipitation processing.Main parameters including solubility,viscosity and recovery of protein of the acid and alkaline solubilization process and recovered with isoelectric precipitation were investigated.Results showed that there was no significant difference in soluble properties between SMP-1and SMP-2.Both SMP-1and SMP-2 showed a maximum solubility at pH 2.5 and 11.5,and their isoelectric pH were found at 5.5. Their viscosity were both changing with solubility,but the SMP-1 higher viscosity than the SMP-2 did.The acidaided and alkali-aided processes had effect on the yield of protein recovered in the same way,leading to very high recoveries of protein,90.5%for IMP-1 and 89.5%for IMP-2.

silver carp;ordinary muscle;dark muscle;protein isolate;isoelectric precipitation processing

TS254.9

A

2095-1388(2011)06-0539-05

2011-01-10

遼寧省海洋與漁業(yè)廳科研計(jì)劃項(xiàng)目(200913)

傅潤澤(1988-),男,碩士研究生。E-mail:furunze@126.com

劉俊榮(1963-),女,教授,博士。E-mail:ljunrong@dlou.edu.cn