周 艾,方如平,戴 樸,李 琦

1)南京醫(yī)科大學附屬南京兒童醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科 南京 210008 2)中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科 南京100853 3)南京醫(yī)科大學附屬南京兒童醫(yī)院兒童聽力中心南京 210008

#通訊作者,男,1971年5月生,博士,副主任醫(yī)師,研究方向:兒童聽力學、耳聾基因診斷及耳鼻咽喉-頭頸外科臨床,E-mail: liqi71520@sina.com

隨著耳聾基因診斷技術的進步,耳聾相關基因檢測已經(jīng)廣泛使用,并應用于耳聾的早期干預,研究表明[1],GJB2、SLC26A4和線粒體基因(m tDNA)的病理性突變導致了大部分的非綜合征性遺傳性耳聾。利用基因診斷技術對上述 3個基因檢測,可在約 70%的遺傳性耳聾患者中發(fā)現(xiàn)致聾基因突變[2-5]。檢測攜帶者能夠為其提供產前咨詢,繼而進一步產前診斷,從而避免再次孕產耳聾兒。現(xiàn)將南京醫(yī)科大學附屬南京兒童醫(yī)院以生育為目的的兒童聽力障礙遺傳學檢測結果分析報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 南京兒童醫(yī)院兒童聽力中心聽力門診就診的已經(jīng)育有一個耳聾患兒的家庭,有生育第二胎的強烈愿望。共 13個家庭納入該項研究,父母聽力正常,家族中無其他遺傳性疾病史。先證者行ABR或純音測聽(行為測聽)檢查,聽力損失為中度至極重度耳聾,其中語前聾 9例,語后聾 4例,年齡6個月～8歲。顳骨薄層 CT發(fā)現(xiàn)大前庭水管綜合征(enlarged vestibular aqueduct syndrome, EVAS)2例。

1.2 患兒GJB 2、SLC26A4及m tDNA 1494、1555位點突變篩查

1.2.1 DNA制備 收集先證者及父母的外周靜脈血樣本,應用試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取血液基因組DNA,紫外分光光度計進行定量和純度檢測,保存于 -20℃冰箱備用。

1.2.2 GJB2基因的PCR檢測 GJB2上游引物序列5'-TTGGTGTTTGCTCAGGAAGA-3',下游引物序列5'-GGCCTACAGGGGTTTCAAAT-3',擴增產物大小為944 bp。引物由南京金斯特生物技術公司合成。PCR反應體系:100 ng的基因組DNA,10×Buffer(含MgCl215mmol/L)緩沖液5μL,10×dNTP(15 mmol/ L)5μL,2 nmol/L上、下游引物各2.5μL,Taq酶(北京泰格美科技有限公司)1μL,加雙蒸水至 50μL。PCR反應條件:94℃預變性5min;94℃變性30 s,58℃復性30 s,72℃延伸 30 s,30個循環(huán);72℃延伸5 min。PCR產物4℃保存。取4μL產物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳(含溴化乙啶0.5mg/L)檢測。

1.2.3 SLC26A4基因第7、8外顯子以及第7內含子全部序列的PCR檢測 上游引物序列5'-CATG GTTTTTCATGTGGGAAGATTC-3',下游引物序列5'-AGACTGACTTACTGACTTAATGT-3',擴增產物大小為502 bp。引物由南京金斯特生物技術公司合成。PCR反應條件退火溫度55℃,其他同GJB2基因。SLC26A4基因其他外顯子反應條件和體系參考文獻[6]。

1.2.4 mtDNA 12S rRNA1494和1555位點檢測上游引物序列5'-CGCCATCTTCAGCAAACCCT-3',下游引物序列5'-TGCGCCAGGTTTCAATTTCTATC-3',擴增產物大小為 468 bp。引物由南京金斯特生物技術公司合成。PCR反應條件同GJB2基因。

1.3 結果判定 對DNA進行Big-Dye測序(美國ABI 3730-Avant Genetic Analyzer測序儀,由南京金斯特生物技術有限公司完成),測序結果采用Gene-Tool Lite 1.0軟件進行比對分析。將GJB2基因和NCBI網(wǎng)站的人類GJB2基因標準序列(ACCESSION:AY280971,VERSION:AY280971.1,GI: 33391196)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/～nucleotide＆val=33391196)進行比對,mtDNA與人類線粒體標準序列(經(jīng)過校正的人類m tDNA劍橋參考序列,Human Mitochondrial DNA Revised Cambridge Reference Sequence,Last updated 2008-06-13)進行比對,SLC26A4基因同GenBank序列(ACCESSION:NT_007933,VERSION:NT_007933.14 GI: 51493052)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ 51493052)進行比對,發(fā)現(xiàn)可疑的突變位點后用Chromas 1.62軟件讀取測序結果的峰圖文件,進行確認或排除。

2 結果

耳聾家庭相關基因檢測結果、遺傳模式及再生育耳聾兒風險見表1和圖1、2。GJB2基因突變4例其中235delC純合突變1例,235delC/299delAT 1例,95G→A(R32H)/235delC 1例,235delC雜合突變1例;SLC26A4基因IVS7-2A→G純合突變1例, IVS7-2A→G/H723R 1例,均為EVAS患者;mtDNA A1555G突變 1例;未發(fā)現(xiàn)突變者 6例。

3 討論

隨著基因組學的迅速發(fā)展,遺傳咨詢也有了新的涵義。根據(jù)美國國家遺傳學協(xié)會的定義:遺傳咨詢是幫助人們理解和適應與疾病相關的遺傳因素對醫(yī)學、心理和家庭影響的過程,其內容包括:解釋家族史和疾病史,評估疾病的發(fā)生或再發(fā)的風險,進行疾病相關遺傳、檢測、治療、預防及目前研究的教育,遺傳咨詢以使患者及/或親屬了解知情選擇權以及對于疾病風險的接受[7]。耳聾基因診斷產前咨詢的作用包括:患兒發(fā)生遺傳性耳聾的可能性;處于遺傳風險家庭的發(fā)現(xiàn)以及家庭對于遺傳學檢測的選擇;遺傳模式和再發(fā)的風險。

該組患兒均為隱性遺傳性耳聾,沒有家族史,家庭中只有一個聾兒,迫切地希望了解孩子耳聾的原因以及下一個孩子發(fā)生耳聾的幾率。作者選擇檢測GJB2全序列、SLC26A4全序列和mtDNA 12S rRNA基因 1494和 1555位點,其突變在遺傳性耳聾中占有較高比例,并且可以在短期內完成檢測,從而為耳聾的基因診斷和遺傳咨詢提供了良好的機會[8-10]。

13個家庭中與GJB2基因相關者4個,GJB2基因突變是兒童感音神經(jīng)性耳聾的主要原因,盡管GJB2單雜合突變不能完全解釋耳聾原因,但仍支持遺傳因素參與發(fā)病[11]。SLC26A4基因共21個外顯子,但SLC26A4基因外顯子7和外顯子8的IVS7-2 A→G突變是中國漢族人群的主要突變,占所有SLC26A 4突變的 63.5%,65.7%的患者攜帶此突變[12-13]。該研究發(fā)現(xiàn)SLC26A 4 IVS7-2A→G純合突變和復合突變2例,顳骨CT檢查均為EVAS,提示對于SLC26A4基因的耳聾,顳骨CT掃描必不可少,對于EVAS患兒有針對性的檢測可以大大提高檢測效率,陽性者行SLC26A 4基因全序列檢測,陰性者可僅行SLC26A4IVS7-2A→G突變檢測。mtDNA A1555G突變與氨基糖甙類藥物誘發(fā)的耳聾密切相關,發(fā)生率相對較前兩者低,該研究中發(fā)現(xiàn) 1例。線粒體COI基因7445位點和藥物性耳聾的關系尚有爭議,該研究未做檢測[14]。

產前咨詢其目的是提供信息和幫助家庭做出選擇,為新生兒今后的健康與教育提供指導。對于檢查陽性結果的家庭,必須解釋再生育的風險,產前診斷可以在父母同意的情況下進行。先證者與父母的基因檢測給了父母選擇的機會,采取避孕或產前診斷的方法終止妊娠。

總之,產前咨詢著重關注父母需要、倫理道德方面、法律的、職業(yè)的、經(jīng)濟上的考慮,使患兒父母有權知道耳聾基因診斷的益處和潛在的風險,但不能過度夸大耳聾基因診斷的作用,以免使父母產生不恰當?shù)钠谕?/p>

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