李洪軍,汪 偉,張 偉,曲國(guó)立,邢云天,李幼子,魏劍英,戴建榮,梁幼生

(1.江蘇省血吸蟲病防治研究所,江蘇 無(wú)錫 214064; 2.衛(wèi)生部 寄生蟲病預(yù)防與控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214064)

血吸蟲病是一種嚴(yán)重危害人類健康、影響社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的“被忽略”的熱帶病(Neglected Tropical Diseases)[1],全球有76個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行血吸蟲病,感染者超過(guò)2億,近8億人口面臨感染威脅[2]。在我國(guó),日本血吸蟲病仍然是重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題[3-5]。截至2010年底,全國(guó)仍有血吸蟲病患者約51.6萬(wàn)[6]。經(jīng)過(guò)多年積極防治,我國(guó)的血吸蟲病流行區(qū)主要被壓縮在長(zhǎng)江中、下游沿岸5省(湖南、湖北、江西、安徽和江蘇)的江湖洲灘地區(qū)[7-10]。釘螺是日本血吸蟲的唯一中間宿主,是構(gòu)成血吸蟲病傳播的不可缺失環(huán)節(jié)[11]。研究表明,凡有血吸蟲病流行的地區(qū)必有釘螺孳生[12]?？刂婆c消滅釘螺是阻斷血吸蟲病傳播的有效措施之一[13-14]。

既往已有采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)中國(guó)大陸釘螺系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行研究的報(bào)道[15-18],亦有學(xué)者對(duì)湖北省廟河地區(qū)和長(zhǎng)江三峽庫(kù)區(qū)釘螺線粒體基因遺傳變異進(jìn)行了探討[19-20]。本研究通過(guò)對(duì)長(zhǎng)江中、下游血吸蟲病流行區(qū)江蘇、安徽、江西、浙江和湖北 5省8個(gè)地理株湖北釘螺線粒體DNA細(xì)胞色素C氧化酶亞單位1(CO I)基因進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析,探討其核酸特異性,為進(jìn)行長(zhǎng)江中、下游地區(qū)釘螺遺傳變異研究、建立DNA 指紋檢測(cè)平臺(tái)及釘螺分子鑒定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 釘螺樣本采集

分別采自長(zhǎng)江中、下游地區(qū)的江蘇、湖北、安徽、江西、浙江4個(gè)省的8個(gè)流行區(qū)現(xiàn)場(chǎng)釘螺,釘螺采集地分別為江蘇丹徒和邗江、湖北武昌、安徽安慶和貴池、江西彭澤和余干、浙江平湖。所有釘螺均為肋殼釘螺,系湖北釘螺指名亞種(Oncomelania hupensis hupensis)。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)后,采用群體逸蚴法鑒定釘螺是否感染血吸蟲,選擇陰性成螺備用。

1.1.2 主要儀器與試劑

PCR儀為德國(guó)analyticjena公司產(chǎn)品,臺(tái)式離心機(jī)為德國(guó)Eppendorf 公司產(chǎn)品; 基因組DNA抽提試劑盒購(gòu)自 promega公司,Taq DNA 聚合酶購(gòu)自promega公司。

1.2 方法

1.2.1 釘螺基因組DNA的提取

選擇每一地理株釘螺3～5只,徹底洗凈后,去除螺殼及內(nèi)臟腸管組織,將剩余組織進(jìn)行混合,移入 EP管中,加入蛋白激酶 K,混勻,55 ℃水浴過(guò)夜。用基因組 DNA抽提試劑盒提取釘螺基因組DNA,并在核酸蛋白分析儀上測(cè)定 DNA濃度和純度。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物鑒定、測(cè)序

上游引物 P1：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′,下游引物 P2：5′ -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAAYCA-3′,由上海生物工程有限公司合成。50 μL 反應(yīng)體系為：10×reaction buffer 5.0 μL,25mmol/L MgCl25.0 μL,dNTP 2.0 μL,上、下游引物各 2.0 μL,模板 DNA 1.0 μL,Taq DNA聚合酶 1.0 μL,用ddH2O補(bǔ)足反應(yīng)體系。反應(yīng)循環(huán)條件為：94 ℃預(yù)變性10 min,94 ℃變性1 min,55 ℃退火90 s(COI),72 ℃延伸1 min,共35個(gè)循環(huán),末次循環(huán)72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,并將擴(kuò)增產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)公司測(cè)序。

1.2.3 CO I 基因序列分析

將測(cè)序結(jié)果先用ClustalX 1.81軟件進(jìn)行多序列比對(duì),再在 MEGA 4.0軟件中的 Kimura 雙參數(shù)法(Kimura 2-Parameter)計(jì)算遺傳距離,分別用鄰接法(NJ)和最大簡(jiǎn)約法(MP) 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹,Bootstrap進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 CO I 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

以 8個(gè)不同地理株湖北釘螺基因組 DNA 為模板,PCR 特異性擴(kuò)增線粒體DNA CO I 基因,均在長(zhǎng)度約700 bp 附近均擴(kuò)增出一目的條帶,與預(yù)期目的片段大小一致。

2.2 CO I基因序列分析

經(jīng)過(guò) ClustalX 1.81 軟件比對(duì),刪除多變區(qū)后,得到701個(gè)同源位點(diǎn),其中有保守位點(diǎn)663個(gè),可變位點(diǎn)38個(gè),簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)26個(gè)。A、T、C和G的堿基平均含量分別為22.8%、37.6%、18.8%、20.8%,A＋T平均含量為 60.4%,C＋G平均含量為 39.6%,A/T含量明顯偏高。表1給出了基于Kimura雙參數(shù)模型序列分歧矩陣。最終得出所有序列間的平均遺傳距離為0.025(表1)。

表1 本研究中不同地理株間的遺傳距離(基于Kimura雙參數(shù)模型)Tab.1 The genetic distances based on the formula of Kimura 2 parameters among snails from different areas in this study

2.3 基于CO I基因序列的分子系統(tǒng)樹

本研究采用鄰接法和最大簡(jiǎn)約法共構(gòu)建了 2種分子系統(tǒng)樹：NJ樹和 MP樹。NJ樹中的分支檢驗(yàn)置信值和后驗(yàn)值低于 50%的則未顯示。NJ進(jìn)化樹顯示,江蘇丹徒、湖北武昌、江西余干及安徽安慶和貴池5個(gè)地理株的釘螺形成一個(gè)分支,而浙江平湖、江蘇邗江和江西彭澤3個(gè)地理株釘螺形成另一個(gè)分支; 但兩種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹存在差異。在內(nèi)部分支檢驗(yàn)置信值在大于 80%時(shí)很相近(圖 1、圖 2)。

圖1 基于CO I基因部分序列構(gòu)建的NJ樹(各分支上數(shù)字為1 000次內(nèi)部分支檢驗(yàn)置信值)Fig.1 The NJ tree based on CO I gene sequence data(Numbers on each node correspond to their bootstrap values for 1000 replicates.)

圖2 基于CO I基因部分序列構(gòu)建的MP樹各分支上的數(shù)字為bootstrap1 000個(gè)循環(huán)的自舉檢驗(yàn)值Fig.2 The MP tree based on partial of CO I gene sequences data with confident values of Bootstrap 1 000 indicated above each branch

3 討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展,線粒體DNA、核糖體DNA和RNA、微衛(wèi)星DNA、單核苷酸多態(tài)性(SNP)和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)等多種分子遺傳研究方法和遺傳標(biāo)記的出現(xiàn),為湖北釘螺遺傳多態(tài)性及其分子系統(tǒng)學(xué)的研究提供了更豐富的手段[21-22]。線粒體DNA作為一種核外遺傳物質(zhì),具有以母性遺傳為主,進(jìn)化速率快,較易發(fā)生突變,其突變頻率約為核基因組的 5～10 倍,且基因重組率極低,同一個(gè)體組織中的線粒體 DNA 具有一致性等特點(diǎn),使它成為生物進(jìn)化過(guò)程中譜系發(fā)生和遷移流動(dòng)的有效遺傳標(biāo)記,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于寄生蟲屬、種及種群水平相互關(guān)系的研究[19,23-26]。

本研究通過(guò)對(duì)長(zhǎng)江中、下游地區(qū) 8個(gè)不同地理株湖北釘螺線粒體 DNA CO I 基因進(jìn)行序列分析,從分子水平上探明其種群內(nèi)的遺傳差異。研究發(fā)現(xiàn),不同地域株湖北釘螺遺傳差異顯著,平均遺傳距離為 0.025。進(jìn)化樹顯示,江蘇丹徒、湖北武昌、江西余干及安徽安慶和貴池 5個(gè)地理株釘螺形成一個(gè)分支,而浙江平湖、江蘇邗江和江西彭澤3個(gè)地域釘螺形成另一個(gè)分支。這可能與長(zhǎng)江中、下游地區(qū)形成的天然地理隔離和生態(tài)環(huán)境差異有關(guān),支持 Davis等[27]對(duì)湖北釘螺的分類結(jié)果。Wilke等[17]對(duì)釘螺cox1基因序列研究發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)江中下游地區(qū)光殼和肋殼釘螺之間遺傳變異很小,同屬指名亞種。石朝輝等[28]發(fā)現(xiàn)同一地區(qū)光殼與肋殼釘螺 cox1 基因序列之間有較高的同源性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,長(zhǎng)江中、下游地區(qū)湖北釘螺種群內(nèi)存在較高的核苷酸多態(tài)性,遺傳差異較顯著,且兩種方法構(gòu)建的進(jìn)化樹存在差異。由于線粒體涉及絕大多數(shù)真核生物的呼吸代謝,線粒體DNA 含有12 或13 種呼吸鏈酶原復(fù)合物中重要蛋白的編碼基因,具有豐富的遺傳特征,在生物進(jìn)化過(guò)程中受到的選擇壓力較大。因此,線粒體 DNA序列的進(jìn)化要快于細(xì)胞核基因[29]。這一遺傳差異的原因及其會(huì)否導(dǎo)致螺宿主對(duì)日本血吸蟲易感性差異有待于進(jìn)一步研究。

本研究采用線粒體DNA CO I基因分子標(biāo)記獲得了長(zhǎng)江中、下游血吸蟲病流行區(qū)湖北釘螺種群CO I基因序列差異,為進(jìn)一步構(gòu)建中國(guó)大陸湖北釘螺遺傳多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)和DNA 指紋檢測(cè)平臺(tái)奠定了基礎(chǔ)。建立的分子技術(shù)可對(duì)現(xiàn)場(chǎng)采集到的釘螺進(jìn)行地理種株和親緣關(guān)系鑒定。

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