張 帥 劉婷婷 周 琳 陳安國 洪奇華 楊彩梅

(浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,杭州 310029)

單胃動物體內(nèi)葡萄糖的吸收部位是小腸,小腸黏膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體在葡萄糖的吸收過程中起著重要作用,小腸葡萄糖的吸收分為主動吸收和被動吸收,參與主動吸收的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)主要是鈉葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 1(SGLT1),而被動吸收主要依靠腸腔微絨毛基底部的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 2(GLUT2)完成。SGLT1主要分布在小腸黏膜的刷狀緣,負(fù)責(zé)由食物中吸收葡萄糖和半乳糖,還可參與細(xì)胞自救,具有防止腸細(xì)胞凋亡等功能[1-2],SGLT1的表達(dá)受到食物、年齡和動物健康狀況的影響[3]。而 GLUT2主要分布于小腸、腎小管、肝臟和胰島 β細(xì)胞中,它不僅在葡萄糖的吸收方面有重要作用,在保證細(xì)胞內(nèi)外葡萄糖快速平衡、感受葡萄糖刺激的應(yīng)答中也起著重要作用,而且與糖尿病關(guān)系密切[4]。SGLT1可以通過激活蛋白激酶 C(PKC)依賴性通路調(diào)節(jié) GLUT2對葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)[5-6]。因此,對 SGLT1和 GLUT2 m RNA表達(dá)方面的研究對了解葡萄糖的吸收和糖代謝的調(diào)控具有重要作用。目前對 SGLT1和 GLUT2 mRNA表達(dá)規(guī)律的研究較少,且主要集中在雞和嚙齒類動物領(lǐng)域[7-8]。王修啟等[7]研究發(fā)現(xiàn),隨著肉雞腸道空間位置的后移,SGLT1 mRNA的表達(dá)量逐步降低;宋曉丹等[8]研究表明,β-酪啡肽 -7可以通過降低 Na+K+-ATP酶活力及下調(diào) SGLT1和GLUT2mRNA表達(dá)量,減少大鼠小腸對葡萄糖的吸收。而在斷奶仔豬中 SGLT1和 GLUT2的報道較少。張磊等[9]研究了斷奶前后仔豬十二指腸、空腸和回腸 SGLT1 m RNA表達(dá)量的變化[9]。對于 GLUT2在仔豬小腸黏膜中的表達(dá)方面的研究目前還未見報道,因此,研究仔豬斷奶階段 SGLT1和 GLUT2mRNA的表達(dá)模式對于了解斷奶仔豬的營養(yǎng)物質(zhì)的吸收具有重要意義。

谷氨酸胺(glutamine,GLN)作為一種條件性必需氨基酸,具有維持小腸絨毛結(jié)構(gòu)和功能完整性,緩解應(yīng)激引起的腸黏膜萎縮的作用。研究表明,GLN能顯著改善仔豬斷奶后 1周內(nèi)小腸對單糖的吸收功能[10-11],并能顯著促使骨髓、空腸黏膜抗菌肽 PR-39及骨髓組織抗菌肽 PG-1 mRNA表達(dá)量上調(diào),減緩免疫抑制[12]。由于小腸黏膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(主要是 SGLT1和 GLUT2等)在葡萄糖吸收過程中起著重要作用,所以推測 GLN有可能通過對小腸黏膜 SGLT1和 GLUT2 mRNA的表達(dá)而影響小腸對葡萄糖的吸收。

本試驗旨在研究仔豬早期斷奶后十二指腸、空腸和回腸 SGLT1和 GLUT2 m RNA表達(dá)量隨時間變化的規(guī)律,以及谷氨酰胺對 SGLT1和 GLUT2 mRNA表達(dá)量的影響,為進(jìn)一步研究小腸的營養(yǎng)吸收機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

谷氨酰胺：純度≥99.9%,購自于浙江省東陽化學(xué)制藥廠。

1.2 試驗設(shè)計及屠宰取樣

選擇 21日齡斷奶的杜 ×長 ×大仔豬 69頭,斷奶當(dāng)天屠宰 3頭豬;剩余 66頭隨機(jī)分成 2組,每組3個重復(fù),每個重復(fù) 11頭仔豬。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧(不添加谷氨酰胺),試驗組飼喂基礎(chǔ)飼糧 +1%谷氨酰胺。試驗基礎(chǔ)飼糧按照 NRC(1998)標(biāo)準(zhǔn)配制成粉狀全價料,基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表 1,試驗組飼糧以 1%GLN等量替代玉米。

表 1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of basal diet(air-dry basis) %

斷奶當(dāng)天屠宰 3頭,在斷奶后第 3、5、7和 14天分別從對照組和試驗組各抽取 3頭接近平均體重的健康仔豬進(jìn)行屠宰(共屠宰 5次,合計 27頭)。屠宰后,迅速剖開腹腔,立即結(jié)扎賁門瓣、幽門瓣、直腸遠(yuǎn)段,將消化道取出,小心剝離開。在十二指腸近端 5 cm處、空腸近端 1/4處、回腸中段分別取 10～15 cm的腸管,適當(dāng)用力擠凈內(nèi)容物后用少量預(yù)冷生理鹽水沖洗,再用載玻片刮取腸黏膜放入 1.5 m L離心管中,-80℃保存。

1.3 總 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

總 RNA抽提試劑 Trizol購自 Invitrogen公司;提取的總RNA利用超微量分光光度計(NanoDrop 1000 Spectrophotometer,美國)檢測 260和 280 nm下的吸光度。

使用 RT reagents反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.4 引物設(shè)計

熒光定量 PCR引物采用 Primer 5.0軟件設(shè)計,由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成,引物序列及參數(shù)見表 2。

表 2 實時定量PCR特異性引物序列及參數(shù)Tab le 2 Sequence and parameters o f specfic p rimers for real-tim e PCR

1.5 反應(yīng)體系及條件

以 18S rRNA管家基因作為內(nèi)參,對 SGLT1和 GLUT2進(jìn)行相對定量分析。實時定量 PCR試劑盒 SYBR Prem ix Ex Taq購自 Takara公司,反應(yīng)在實時定量 PCR儀(ABI 7500 Real-Time PCR System,美國)上進(jìn)行。

25μL擴(kuò)增體系：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2μL,Premix Ex TaqTM(2×)10.0μL,10μmol/L上游、下游引物適量(SGLT1上下游引物各 0.4μL、GLUT2上下游引物各 2.0μL、18S rRNA上、下游引物各0.2μL),ROX Reference DyeⅡ (50×)0.4μL;滅菌蒸餾水加至總體積 25μL。

反應(yīng)條件：95℃30 s預(yù)變性;95℃5 s,60℃34 s,進(jìn)行 40個循環(huán)。每循環(huán)第 2步結(jié)束時進(jìn)行熒光信號收集。每個待測樣品設(shè)置 3個重復(fù),對得到的 3個閾值循環(huán)(Ct值),取平均值,以備帶入公式進(jìn)行計算。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別將 18S rRNA、SGLT1和 GLUT2 3個基因的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用去離子水梯度稀釋成 1～10-7,選擇 1～10-4共 5個濃度為標(biāo)準(zhǔn)品,標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)條件同上,設(shè)置 3個重復(fù)?；€由實時定量 PCR儀自動設(shè)置,標(biāo)準(zhǔn)曲線由軟件自動分析,得到斜率和擴(kuò)增效率。

1.7 產(chǎn)物測序

PCR產(chǎn)物送杭州博尚生物技術(shù)有限公司測序,采用 Blast軟件將所得到的基因序列與 Gen-Bank中登錄的豬 SGLT1,GLUT2和 18S RNA基因序列進(jìn)行序列同源性比較,測得同源性均為100%。

1.8 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)系統(tǒng)自動分析的 SGLT1、GLUT2以及18S rRNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率可得 PCR擴(kuò)增效率：E=10-1/Slope。

式中：E擴(kuò)增效率,Slope為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

SGLT1、GLUT2和 18S rRNA的擴(kuò)增效率都接近 100%且相互間效率偏差在 5%以內(nèi),以目的基因 mRNA的拷貝數(shù)與對應(yīng)樣品內(nèi)參基因 mRNA的拷貝數(shù)的比值表示基因 mRNA的相對表達(dá)量,運(yùn)用 SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和相關(guān)分析。數(shù)據(jù)采用柱形圖表示,誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié) 果

2.1 總 RNA抽提

由圖 1可知,條帶依次為 28S、18S和 5S rRNA,其中 28S條帶亮度大約為 18S條帶的 2倍。分光光度計測定總 RNA OD260nm∶OD280nm為1.82～2.05,說明總 RNA樣品完整、降解較少、質(zhì)量良好,可用于進(jìn)一步實驗操作。

圖 1 總 RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA

2.2 實時定量 PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用模板為 1～10-4共 5個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)cDNA分別進(jìn)行 SGLT1、GLUT2和 18S rRNA定量 PCR反應(yīng),得到實時定量 PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線,曲線擬合度(R2)為 0.999 2～0.999 9,擴(kuò)增效率為99.6%～105.8%,效率及擬合度均良好,可用于表達(dá)量定量分析。

2.3 斷奶仔豬不同腸段間 SGLT 1和 GLUT2 m RNA表達(dá)量

將對照組仔豬相同腸段不同時間點的 RNA樣品混合后進(jìn)行 PCR反應(yīng),得出 SGLT1m RNA在十二指腸的表達(dá)量較高,回腸其次,空腸中表達(dá)量較低,但各腸段之間差異不顯著(P＞0.05)(圖2A);GLUT2 mRNA在十二指腸的表達(dá)量較高,空腸其次.回腸較低,各腸段之間差異也不顯著(P＞0.05)(圖 2B)。

圖 2 斷奶仔豬不同腸段中SGLT 1和 GLUT 2m RNA的相對表達(dá)量Fig.2 Relative exp ression levels of SGLT 1 and GLUT 2m RNA in different segmento f intestinal of w eanling piglets

2.4 斷奶仔豬 SGLT 1和 GLUT 2mRNA表達(dá)量發(fā)育性變化及谷氨酰胺對其的影響

采用相對定量方案,引入內(nèi)參基因 18S rRNA矯正初始細(xì)胞數(shù)、RNA提取效率等不可控制因素,歸一化起始組織量。將 27頭斷奶仔豬的十二指腸、空腸、回腸相對定量數(shù)據(jù)代入公式計算后得到SGLT1和 GLUT2 mRNA在不同腸段中的表達(dá)規(guī)律。

由圖 3A可知,SGLT1 mRNA在十二指腸的表達(dá)量從斷奶后第 3天開始逐漸升高,第 14天達(dá)到最高值;第 3天的 SGLT1 mRNA表達(dá)量顯著低于斷奶當(dāng)天(第 0天),第 14天表達(dá)量顯著高于其他各天(P＜0.05)。由圖 3B可知,SGLT1mRNA在空腸的表達(dá)量變化趨勢與在十二指腸中有一定的相似性,試驗組和對照組表達(dá)量分別從斷奶后第 3、5天開始呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢,均在第 14天達(dá)最大值,與其他時間點差異顯著(P＜0.05)。由圖 3C可知,SGLT1 mRNA在回腸的表達(dá)量從斷奶至斷奶后第 5天漸升高,在第 7天表達(dá)量有所下降,第 14天達(dá)到峰值,且表達(dá)量顯著高于其他各時間點(P＜0.05)。

由圖 3D可知,GLUT2mRNA在十二指腸的表達(dá)量從斷奶后第 3天開始明顯上升,至斷奶后第 7天達(dá)到峰值,第 14天基本回落到斷奶當(dāng)天水平,第 5、7天表達(dá)量顯著高于其他時間點(P＜0.05)。由圖 3E可知,GLUT2m RNA在空腸的表達(dá)量變化趨勢與十二指腸基本一致,從斷奶后開始明顯上升,至斷奶后第 7天達(dá)到峰值,斷奶后第14天表達(dá)量比第 7天有明顯下降,斷奶后第 7天的表達(dá)量顯著高于其他各時間點(P＜0.05)。由圖 3F可知,GLUT2mRNA在回腸的表達(dá)量從斷奶后開始呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢,表達(dá)量在斷奶后第 5天達(dá)到峰值且差異顯著(P＜0.05),之后便逐漸回落至斷奶當(dāng)天水平。

除斷奶后第 3天空腸 SGLT1的表達(dá)外,其他不同時間點試驗組十二指腸、空腸和回腸黏膜SGLT1和 GLUT2 mRNA表達(dá)量均高于對照組,但差異不顯著(P＞0.05)。表明飼糧中添加 GLN對小腸黏膜 SGLT1和 GLUT2mRNA表達(dá)量無顯著影響。

圖 3 SGLT 1和 GLUT 2m RNA在斷奶仔豬十二指腸、空腸、回腸的相對表達(dá)量Fig.3 Relative expression levels of SGLT1 and GLUT2mRNA in duodenum,jejunum and ileum of weanling piglets

2.5 SGLT 1和 GLUT2 m RNA表達(dá)量的相關(guān)性

各基因 mRNA表達(dá)量變化趨勢間的相關(guān)系數(shù)越高,說明基因間的協(xié)同性越強(qiáng)。對試驗中不同腸段 SGLT1和 GLUT2表達(dá)量的 Bivariate相關(guān)性分析結(jié)果表明：各腸段 SGLT1和 GLUT2 mRNA相對表達(dá)量變化趨勢間均不存在線性相關(guān)趨勢。十二指腸中 SGLT1和 GLUT2間的相關(guān)系數(shù)為0.242 66,空腸中為 0.315 60,回腸中為-0.109 90,均未達(dá)到顯著相關(guān)。

3 討 論

在單胃動物小腸內(nèi),食物中的碳水化合物主要通過腸黏膜以單糖形式吸收,其中葡萄糖占80%。腸道中的單糖先在腸黏膜細(xì)胞刷狀緣上與SGLT1結(jié)合并由 SGLT1轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞,在細(xì)胞內(nèi)造成高濃度的聚積后,順濃度梯度再與腸黏膜細(xì)胞基底膜側(cè) GLUT2結(jié)合,通過易化擴(kuò)散穿越基底膜進(jìn)入組織間隙[13],因此,SGLT1和 GLUT2在小腸的碳水化合物吸收中起著重要作用。

目前關(guān)于 SGLT1在十二指腸、空腸和回腸的表達(dá)量的差異方面的報道較少,而且結(jié)果有較大的差異。Freeman[14]用原位雜交的方法檢測兔小腸 SGLT1 mRNA的豐度,發(fā)現(xiàn)十二指腸中的SGLT1表達(dá)量較低,空腸和回腸的表達(dá)量較高,但不同腸段之間差異不顯著。張磊等[9]研究了斷奶前后仔豬十二指腸、空腸和回腸 SGLT1 mRNA表達(dá)量的變化,結(jié)果表明回腸表達(dá)量最高、空腸其次、十二指腸最低,且差異顯著。王修啟等[7]研究了愛拔益加(AA)肉雞不同腸段葡萄糖吸收轉(zhuǎn)運(yùn)主要載體 SGLT1和 GLUT2m RNA表達(dá)的組織特異性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著腸道空間位置的后移,SGIT1 mRNA表達(dá)量逐步降低,十二指腸與空腸 GIUT2 mRNA表達(dá)量高于回腸和結(jié)直腸。而本試驗發(fā)現(xiàn)斷奶仔豬十二指腸、空腸和回腸 SGLT1和 GLUT2 mRNA表達(dá)量并無顯著差異,十二指腸的表達(dá)量略高于空腸和回腸。這可能是由于檢測方法的差異,也可能是由于動物種屬、年齡以及小腸采樣位置的影響。

王修啟等[7]研究了 AA肉雞和黃羽肉雞十二指腸 SGLT1和 GLUT2 mRNA表達(dá)發(fā)育規(guī)律,結(jié)果表明 AA肉雞和黃羽肉雞 SGLT1m RNA表達(dá)從2～30日齡不斷升高,44日齡下降,55日齡回升;AA肉雞和黃羽肉雞 GLUT2 mRNA表達(dá)在 2～30日齡呈現(xiàn)升高的趨勢,AA雞 44和 58日齡時GLUT2mRNA表達(dá)量顯著低于 30日齡(P＜0.05),而黃羽肉雞 GLUT2 mRNA表達(dá)量 58日齡時顯著高于 30日齡 (P＜0.05)[7]。Khan等[15]的研究表明,斷奶后和成年大鼠空腸 SGLT1蛋白含量高于哺乳期[15]。本試驗的結(jié)果表明,SGLT1 mRNA在十二指腸和空腸的表達(dá)量的變化趨勢基本一致,都是從斷奶后第 3天逐漸上升,至第 14天達(dá)到峰值。而回腸的變化趨勢略有不同,從斷奶后就開始上調(diào),至 14天達(dá)到峰值,回腸 SGLT1 mRNA表達(dá)量受到斷奶的影響相對較小。GLUT2 mRNA在十二指腸和空腸中的表達(dá)量從斷奶第3～7天呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢,第 7天達(dá)到顯著水平(P＜0.05),但在第 14天降至斷奶當(dāng)天水平,回腸 GLUT2表達(dá)量在斷奶后第 5天達(dá)到最高水平,而后逐漸回落至斷奶當(dāng)天水平?；啬c SGLT1和GLUT2mRNA表達(dá)量與十二指腸和空腸不同的原因可能在于回腸除能夠吸收一部分葡萄糖外,還大量吸收水分和鹽分,因為腸黏膜 SGLT1可以逆滲透壓共轉(zhuǎn)運(yùn) Na+和水分子[16]。

谷氨酰胺作為一種條件性必需氨基酸,在動物處于特殊生長階段如斷奶期或應(yīng)激期間可顯著提高小腸對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力[9,17]。有研究表明綿羊小腸上皮黏膜對單糖的吸收功能與 SGLT1表達(dá)呈正相關(guān)[18]。但本試驗的結(jié)果表明：飼糧中添加谷氨酰胺對 SGLT1和 GLUT2mRNA表達(dá)量并無顯著影響,因此推測谷氨酰胺對 SGLT1和GLUT2mRNA表達(dá)量的影響可能不是在轉(zhuǎn)錄水平上,而是在轉(zhuǎn)錄后水平。Barfu ll等[19]研究發(fā)現(xiàn),白色來航雞空腸 SGLT1表達(dá)量在 2日齡和 5周齡時無明顯差異,但在蛋白水平上,2日齡明顯比 5周齡要高,提示年齡對 SGLT1表達(dá)的影響是轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。K les等[20]報道,在大鼠小腸中原位灌注甘露醇、葡萄糖、谷氨酰胺后,缺氧條件下SGLT1活性在翻譯后水平受到調(diào)控而降低。Lescale-M atys等[18]等對羊的研究表明,SGLT1蛋白濃度與其轉(zhuǎn)運(yùn)活性相一致,但 mRNA豐度與蛋白豐度并不相關(guān),提示小腸 SGLTlmRNA表達(dá)存在轉(zhuǎn)錄后和翻澤后調(diào)控。有關(guān)谷氨酰胺對 SGLT1和GLUT2 mRNA轉(zhuǎn)錄后水平的影響方面的推測還需要進(jìn)一步的研究來證實。

4 結(jié) 論

①斷奶仔豬十二指腸、空腸和回腸中 SGLT1和 GLUT2mRNA的表達(dá)量無顯著差異。

②十二指腸、空腸中 SGLT1 mRNA表達(dá)量從斷奶開始先降低、斷奶后第3天開始升高,第 14天達(dá)峰值,回腸 SGLT1 mRNA表達(dá)量從斷奶開始先升高,斷奶后第 7天較低,第 14天又顯著上升;GLUT2mRNA在十二指腸和空腸中的表達(dá)量從斷奶后第 3～7天呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢,第 7天達(dá)峰值,但在第 14天降至斷奶當(dāng)天水平,回腸GLUT2 mRNA表達(dá)量在斷奶后逐漸升高,第 5天達(dá)峰值,而后逐漸回落至斷奶當(dāng)天水平。

③飼糧添加 1%谷氨酰胺組對 SGLT1和GLUT2 mRNA表達(dá)量無顯著影響。

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