潘廷才 楊林杰 劉善文 李華榮 朱林燕 葉文才 王立偉 陳麗新

細(xì)胞凋亡早期的細(xì)胞容積減小稱為凋亡性細(xì)胞容積減?。╝poptotic volume decrease，AVD）。AVD是具有普遍性意義的細(xì)胞凋亡早期的標(biāo)志性事件，是細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要特征。目前關(guān)于AVD的發(fā)生機(jī)制尚不清楚，有報(bào)道稱氯通道在AVD的發(fā)生過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1]。筆者前期研究表明，抗腫瘤藥物可通過激活氯通道引起AVD，繼而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡而發(fā)揮其抗癌作用[2]。5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-Fu）是臨床上常見的抗癌藥，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是其抗腫瘤的機(jī)制之一[3]。氯通道在5-Fu誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中是否發(fā)揮作用目前尚不清楚。本研究旨在研究氯通道在5-Fu誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用，從離子通道和AVD的角度探討5-Fu在細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 溶液及試劑 等滲灌流液（ISO）含70 mmol/L NaCl，0.5 mmol/L MgCl2，2 mmol/L CaCl2，10 mmol/L HEPES和140 mmol/L D-甘露醇。用D-mannitol調(diào)節(jié)至300 mmol/L。配好的液體用冰點(diǎn)計(jì)（Osmomat030，Gono2tec）檢測溶液滲透壓，用Tris液調(diào)pH值至7.4。5-Fu購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司，氯通道阻斷劑5-硝基-2-（3-苯丙胺）苯甲酸（NPPB）購自Sigma公司。用二甲基亞砜（DMSO）配制成100 μmol/L的儲(chǔ)存液，使用前用灌流液稀釋至100 mmol/L。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 低分化鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z用含10%小牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640生長液培養(yǎng)在37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，按常規(guī)方法傳代。實(shí)驗(yàn)前用0.25%胰酶和0.02%EDTA進(jìn)行消化傳代，收集并重懸細(xì)胞，細(xì)胞懸液接種在直徑22 mm的圓形玻片上，放入培養(yǎng)箱使細(xì)胞貼壁，待細(xì)胞貼壁1 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞容積測量 分別用100 μmol/L 5-Fu（5-Fu組）、100 μmol/L 5-Fu+100 μmol/L NPPB（5-Fu+NPPB組）處理細(xì)胞，另外設(shè)未加任何處理因素的為對(duì)照組。采用筆者前期文獻(xiàn)報(bào)道的方法測定細(xì)胞的容積[4]。將細(xì)胞貼壁生長的玻片安放在特制的0.3 mL浴槽中，灌流速度2 mL/min。在倒置相差顯微鏡（IMT-2，Olympus，Japan）下，選擇并固定拍攝視野，用CCD數(shù)字式攝像機(jī)（Cohu，Inc.USA）每隔2 min拍攝細(xì)胞圖像1幅，用Scion Image圖像分析軟件（Scion Co.，USA）控制拍攝并進(jìn)行細(xì)胞圖像分析，分別選取藥物作用后6、30、60、90和120 min5個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞容積計(jì)算并經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理。標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞容積（Vst）=（Vt/Vo）×100，其中Vt是實(shí)時(shí)測得的細(xì)胞容積，Vo是同一細(xì)胞在等滲條件下的平均容積。所有實(shí)驗(yàn)在室溫20℃～27℃進(jìn)行。

1.4 核DNA染料Hochest 33258熒光染色技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 選用對(duì)數(shù)生長期的CNE-2Z細(xì)胞，接種于24孔板內(nèi)，培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞長至50%～80%滿，5-Fu及5-Fu+NPPB處理后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入0.5 mL固定液，室溫固定10 min，吸去固定液，每孔加入0.5 g/mL Hoechst 33258染色液0.3 mL，在室溫下避光靜置，染色15 min后吸盡染液，PBS液洗2次，然后在倒置熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)，每次每個(gè)實(shí)驗(yàn)組計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞，辨認(rèn)凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見濃染致密的顆粒狀亮藍(lán)色熒光者為凋亡細(xì)胞，呈彌散均勻的淡藍(lán)色熒光者為活細(xì)胞，計(jì)算凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)× 100%，抑制率=（5-Fu組凋亡細(xì)胞數(shù)-5-Fu+NPPB組凋亡細(xì)胞數(shù)）/5-Fu組凋亡細(xì)胞數(shù)×100%。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并重復(fù)3次取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，3組比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組CNE-2Z細(xì)胞Vst比較 細(xì)胞處于等滲液中（處理前），細(xì)胞容積及細(xì)胞形態(tài)保持穩(wěn)定不變。5-Fu處理120 min后，細(xì)胞皺縮，體積變小，部分細(xì)胞由圓形變成不規(guī)則狀，見圖1A、B。細(xì)胞受到5-Fu刺激后，Vst均小于對(duì)照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。細(xì)胞接受5-Fu+NPPB處理后120 min，細(xì)胞體積變化不明顯，見圖1C、D。在5個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，5-Fu+NPPB組對(duì)細(xì)胞Vst的影響均小于5-Fu組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

圖1 NPPB和5-Fu對(duì)CNE-2Z細(xì)胞Vst的影響（×640）

表1 不同時(shí)間3組CNE-2Z細(xì)胞Vst比較（n=16，%，±s）

表1 不同時(shí)間3組CNE-2Z細(xì)胞Vst比較（n=16，%，±s）

＊＊P＜0.01

組別對(duì)照組（1）5-Fu組（2）5-Fu+NPPB組（3）F P（1）∶（2）（2）∶（3）6 min 100.3±0.2 99.5±0.1 100.1±0.2 9.680＊＊0.007 0.001 30 min 100.2±0.3 96.2±0.4 100.4±0.2 32.369＊＊＜0.001＜0.001 60 min 99.6±0.2 91.9±0.4 99.4±0.3 61.313＊＊＜0.001＜0.001 90 min 99.1±0.3 88.8±0.4 98.1±0.4 53.116＊＊＜0.001＜0.001 120 min 99.3±0.4 88.2±0.4 98.5±0.6 111.400＊＊＜0.001＜0.001

2.2 3組CNE-2Z細(xì)胞凋亡情況分析 經(jīng)Hochest熒光染色后，對(duì)照組細(xì)胞染色質(zhì)分布均勻，為彌漫均勻的淡藍(lán)色低強(qiáng)度熒光，見圖2A。細(xì)胞凋亡率（1.8±0.5）%。經(jīng)5-Fu處理細(xì)胞48 h后，呈現(xiàn)出典型的凋亡特征，大量的細(xì)胞核呈濃縮致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光，有明顯的凋亡小體出現(xiàn)，部分核染色體碎片狀，凋亡細(xì)胞明顯增加，凋亡率（49.2± 2.6）%，見圖2B。而經(jīng)5-Fu+NPPB處理后，細(xì)胞核呈濃縮致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光的凋亡細(xì)胞明顯減少。細(xì)胞凋亡率（12.5±2.9）%，抑制率（74.9±3.5）%，見圖2C。

圖2 3組CNE-2Z細(xì)胞Hochest熒光染色圖（Hoechst 33258染色×280）

3 討論

本研究結(jié)果表明，抗癌藥5-Fu在數(shù)分鐘內(nèi)就可使細(xì)胞容積縮小，并隨時(shí)間的延長該作用更明顯，提示早期細(xì)胞皺縮可能是5-Fu抗腫瘤作用的關(guān)鍵步驟或標(biāo)志現(xiàn)象之一。早期AVD已在凋亡誘導(dǎo)劑十字孢堿、腫瘤壞死因子（TNF）-α或Fas配體等誘導(dǎo)的多種細(xì)胞凋亡中觀察到，被認(rèn)為是凋亡過程中具有普遍性意義的標(biāo)志性事件[5]。本研究顯示，氯通道阻斷劑NPPB可抑制5-Fu誘導(dǎo)的細(xì)胞皺縮，提示氯通道的激活是5-Fu誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生AVD的關(guān)鍵因素。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為氯通道被5-Fu激活的機(jī)制是通過非DNA作用途徑激活氯通道，進(jìn)而誘導(dǎo)AVD的發(fā)生。5-Fu主要通過影響DNA的合成或損傷DNA而引起細(xì)胞凋亡耗時(shí)較長，而5-Fu引起的AVD在幾分鐘內(nèi)就可觀察到。有關(guān)氯通道在AVD中的作用，也可在一些其他凋亡誘導(dǎo)劑引起的AVD中觀察到[6]。筆者前期研究顯示氯通道參與凋亡誘導(dǎo)劑順鉑和過氧化氫誘導(dǎo)的AVD[5]。

本實(shí)驗(yàn)表明，5-Fu可誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡，而5-Fu的這一作用可被氯通道阻斷劑NPPB所抑制，提示氯通道的激活是5-Fu誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要環(huán)節(jié)之一，5-Fu可能通過某種未知的機(jī)制激活氯通道，進(jìn)而激活或啟動(dòng)細(xì)胞凋亡機(jī)制，最終引起細(xì)胞凋亡。氯通道與細(xì)胞凋亡的關(guān)系也在凋亡誘導(dǎo)劑順鉑[2]和過氧化氫[5]誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中觀察到。至于在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中，氯通道以及與氯通道有關(guān)的AVD通過何種機(jī)制來參與調(diào)節(jié)不同機(jī)制引起的細(xì)胞凋亡，有待進(jìn)一步研究。

綜上，氯通道的激活與5-Fu誘導(dǎo)的鼻咽癌AVD及凋亡密切相關(guān)，氯通道可能是5-Fu抗腫瘤的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一。

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