劉華俊，王利平，劉慧宏

（1.襄樊學(xué)院 化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院，湖北 襄樊 441053；2.武漢紡織大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，湖北 武漢 430073）

2,4-二氯苯酚與肌紅蛋白相互作用研究

劉華俊1，王利平1，劉慧宏2

（1.襄樊學(xué)院 化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院，湖北 襄樊 441053；2.武漢紡織大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，湖北 武漢 430073）

用瓊脂糖水凝膠在玻碳電極表面固定肌紅蛋白（Mb），研究了Mb與有毒且難降解的有機(jī)污染物2,4-二氯苯酚（2,4-DCP）的相互作用.在無氧的溶液中，2,4-DCP與Mb中的血紅素形成了配合物，但沒有催化反應(yīng)發(fā)生；在氧氣飽和的溶液中，Mb催化2,4-DCP羥基化，表明Mb具有細(xì)胞色素P450單加氧酶的活性.2,4-DCP的濃度在12.5～208 μmol? L-1范圍內(nèi)與催化電流呈線性關(guān)系，檢測(cè)限為 2.06 μmol? L-1.紫外可見光譜證實(shí)2,4-DCP與Mb氨基酸殘基之間存在強(qiáng)烈的作用，409 nm處峰吸收減小，表明血紅素Fe(III)/Fe(II)的價(jià)態(tài)發(fā)生改變，進(jìn)一步證明Mb與2,4-DCP發(fā)生了氧化還原反應(yīng).

2,4-二氯苯酚；肌紅蛋白；細(xì)胞色素P450

2,4-二氯苯酚（2,4-DCP）廣泛存在于農(nóng)藥、染料和增塑劑等生產(chǎn)廢水中，是一種有毒、難降解的有機(jī)污染物.[1]研究2,4-DCP的電化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)，建立降解和檢測(cè)2,4-DCP的電化學(xué)方法，是目前環(huán)境保護(hù)和工業(yè)過程控制等領(lǐng)域感興趣的課題.[2]應(yīng)用化學(xué)修飾電極降解和檢測(cè)2,4-DCP，不僅催化降解的效率更高，而且可以減緩由于在裸電極表面生成聚合物而毒化電極[3-4].細(xì)胞色素P450（P450）是一類參與內(nèi)源性和外源性化合物代謝的酶，對(duì)催化降解有機(jī)鹵化物有較強(qiáng)的選擇性.[5]肌紅蛋白（Mb）具有P450的活性，利用電化學(xué)方法研究Mb模擬P450已有報(bào)道，如固定在電極表面的Mb催化氯代物脫氯[6]、苯乙烯加氧[7]等，但Mb催化2,4-DCP羥基化還未見報(bào)道.本文研究了固定在電極表面的Mb與2,4-DCP的相互作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Mb具有P450單加氧酶活性，在飽和氧溶液中，能催化2,4-DCP羥基化.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

電化學(xué)工作站（CHI812，上海辰華儀器公司），紫外-可見光譜儀（UV-vis Spectrophotometer TU-1901，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），酸度計(jì)（DELTA 320PH）.

取適量馬心肌紅蛋白（Mb，F(xiàn)luka）溶于 10 mmol? L-1磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.0）中，制成蛋白質(zhì)溶液，濃度由分光光度法確定為 1.86× 10-5mol? L-1.瓊脂糖（0.4 g，AG，Sigma）溶解于100 mL沸水中，然后室溫冷卻，配制成0.4%的水凝膠.與蛋白質(zhì)溶液混合前，在瓊脂糖的水凝膠中，加入N,N-二甲基甲酰胺，加速凝膠化過程，DMF與AG的體積比為1∶4. 2,4-DCP（Aldrich）配制為 0.1mol? L-1的乙醇溶液.實(shí)驗(yàn)中使用的緩沖溶液為 0.1mol? L-1磷酸鹽溶液（PBS，pH＝7.0）.乙醇/緩沖溶液混合溶液為無水乙醇與 0.1mol? L-1的緩沖溶液按體積比1∶1混合而成.其他試劑均為分析純.實(shí)驗(yàn)用水為超純水（18 kΩ·cm）.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Mb-AG膜修飾電極的制備

玻碳電極（GCE，CHI，φ4）用6#砂紙打磨后，再用0.05μm粒度的α-Al2O3懸濁液在拋光布上拋光，洗去表面污物，然后在水中超聲清洗3次，每次2～3 min.將瓊脂糖和DMF的混合液與蛋白質(zhì)溶液等體積混合，取5μL混合溶液均勻涂布在新處理的電極表面，罩上有孔的小管，室溫干燥約4 h.制備的修飾電極表示為Mb-AG/GCE，Mb的固載量約為 17× 10-10mol .

1.2.2 直接電化學(xué)測(cè)量

電化學(xué)池由參比電極腔和電化學(xué)反應(yīng)腔（體積約為600μL）兩部分構(gòu)成，其間由魯金毛細(xì)管聯(lián)接，參比電極為飽和甘汞電極（SCE），鉑絲網(wǎng)為輔助電極，工作電極為修飾玻碳電極，循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)使用該電解池.文中的電位值均相對(duì)于飽和甘汞電極.

電流—時(shí)間響應(yīng)實(shí)驗(yàn)在10 mL電解池中進(jìn)行.在電解池中加入4.0 mL 0.1mol? L-1的乙醇/磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.0），磁力攪拌，采用三電極體系，控制工作電極電位為-0.25 V，待信號(hào)穩(wěn)定后，逐次（間隔時(shí)間為40 s）加入 5μL 0.1mol? L-1的2,4-DCP溶液.

1.2.3 紫外可見光譜法

在比色皿中，加入2.0 mL pH=7.0的PBS溶液，首先校正儀器的基線，然后加入20 μL的Mb溶液，再逐次加入5 μL 0.1mol? L-1的2,4-DCP溶液，混合均勻，靜置幾分鐘后，記錄吸收曲線.

2 結(jié)果與討論

2.1 2,4-DCP與Mb作用的電化學(xué)研究

pH=7.0的PBS/乙醇混合溶液中通氮除氧，在-0.8～0.2 V范圍內(nèi)，將Mb-AG/GCE置于其中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，發(fā)現(xiàn)有一對(duì)對(duì)稱的氧化還原峰（見圖1的曲線a），陽極峰與陰極峰電勢(shì)分別為-0.371V和-0 .440 V ，式電勢(shì) (E0′= (Epc+ EPa)/2)為-0.406 V，電勢(shì)差 (Δ Ep= Epc- Epa)為67 mV.這是固定在AG膜中的Mb與電極之間的直接電子傳遞，電化學(xué)反應(yīng)為Mb血紅素輔基中氧化還原中心Fe(III)/Fe(II)的氧化還原.往溶液中加入2,4-DCP，Mb的氧化峰和還原峰電流隨著2,4-DCP濃度的增加同時(shí)稍微增大，峰電位隨著2,4-DCP濃度的增加而負(fù)移（具體見圖1的曲線b、c、d）.2,4-DCP的濃度為 2.0 mmol? L-1時(shí)（圖1的曲線d），陽極峰與陰極峰電勢(shì)分別為 -0 .446 V 和 -0 .516 V，式電勢(shì)為-0.491V，電勢(shì)差(ΔEp)為50 mV.式電勢(shì)負(fù)移、電勢(shì)差變小，氧化和還原峰電流同時(shí)稍微增大等現(xiàn)象說明在無氧條件下，2,4-DCP與Mb存在相互作用，即2,4-DCP與血紅素輔基中Fe(III)/Fe(II)配位，但沒有催化反應(yīng)發(fā)生.即在此條件下，Mb沒有催化2,4-DCP脫氯或羥基化.Mb以血紅素作為活性中心，含有一個(gè)供底物結(jié)合的空缺配位點(diǎn)，其主要功能是載送氧氣，這個(gè)空缺配位點(diǎn)常由一個(gè)弱結(jié)合的水分子所占據(jù)，該水分子很容易被底物分子取代.Mb與底物分子結(jié)合時(shí)，其球蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，造成幾何及電子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，Mb血紅素輔基中Fe(III)/Fe(II)的氧化還原電位也隨之發(fā)生改變.即2,4-DCP與Mb血紅素中空缺配位點(diǎn)結(jié)合，影響了其氧化還原電位和與電極的電子傳遞反應(yīng).在無氧條件下，固定在電極的Mb可以催化氯代乙烷[6]或三氯乙酸脫氯[7].脫氯反應(yīng)與Cl—C鍵能有關(guān)，氯原子與苯酚鍵合較強(qiáng)且易形成較穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，但相比于氯代烷烴，2,4-DCP較難脫氯.

在pH=7.0的除氧緩沖溶液中，Mb-AG/GCE的循環(huán)伏安圖只出現(xiàn)了Fe(III)/Fe(II)電對(duì)的氧化還原峰；但在飽和氧氣的緩沖溶液中，Mb-AG/GCE出現(xiàn)了較大的還原峰，同時(shí)伴隨著氧化峰的消失（見圖2曲線a），這是Mb電催化還原氧氣的反應(yīng).氧氣能可逆地與Mb的血紅素鍵合，形成Mb Fe(II)-O2，即氧合肌紅蛋白，此時(shí)MbFe(II)的電子部分地輸送給O2，從而使鐵原子接近三價(jià)鐵狀態(tài)MbFe(III).MbFe(II)-O2可在電極表面還原，當(dāng)MbFe(II)-O2還原為MbFe(II)時(shí)，MbFe(II)又能快速地結(jié)合O2，便產(chǎn)生了較大的催化電流（見圖2曲線a）.

圖1 在通氮除氧的PBS溶液中，Mb-AG/GCE與2,4-DCP作用的循環(huán)伏安曲線

圖2 在氧氣飽和的PBS溶液中，Mb-AG/GCE與2,4-DCP作用的循環(huán)伏安曲線

往溶液中加入2,4-DCP，還原峰電流有較大的增加，而且隨著2,4-DCP濃度的增加而增大，峰電勢(shì)也逐漸負(fù)移（見圖2曲線b、c、d）.這是Mb-AG/GCE在氧氣中存在時(shí)，與2,4-DCP發(fā)生催化反應(yīng)的結(jié)果.反應(yīng)機(jī)理表示如下：

自然界中，細(xì)胞色素P450是催化降解氯酚選擇性較強(qiáng)的酶.[8]在無氧狀態(tài)下，P450催化一些有機(jī)鹵化物脫去鹵素元素；而在有氧環(huán)境中，P450催化一些有機(jī)鹵化物加氧進(jìn)而羥基化.但由于細(xì)胞色素P450難以實(shí)現(xiàn)直接電子傳遞，所以只有利用電子媒介體才能催化2,4-DCP羥基化[9].而在AG膜內(nèi)，Mb可與電極直接傳遞電子，有氧氣存在時(shí)能催化2,4-DCP羥基化，于是推定Mb具有細(xì)胞色素P450酶活性.

2,4-DCP的濃度在0.12～0.81 mmol? L-1范圍內(nèi)與催化電流呈線性關(guān)系，線性方程為I (μA) = 2.26+ 1.74c (mmol? L-1)，R=0.987.由于在電位掃描過程中，電極產(chǎn)生了較大的充電電流，此外催化電流與電位掃描速度的平方根呈正比，說明反應(yīng)受擴(kuò)散控制，即2,4-DCP或氧氣的擴(kuò)散系數(shù)影響催化電流的大??；因此，在攪拌條件下，增加傳質(zhì)速度檢測(cè)2,4-DCP，將會(huì)改善分析結(jié)果，即濃度的線性范圍變寬、檢測(cè)限降低、靈敏度提高.

在10 mL電解池中加入 0.1mol? L-1的乙醇/磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.0）4.0 mL，磁力攪拌，控制工作電極電位為-0.25 V，逐次加入 5 μL 0.1mol? L-1的2,4-DCP溶液，記錄I—t曲線（圖3）.從圖中可以看出，2,4-DCP與Mb的反應(yīng)速度較快，達(dá)到平衡電流的時(shí)間小 于 3s.2,4-DCP 濃 度 在 12.5～208 μ mol? L-1范圍內(nèi)與催化電流呈線性關(guān)系，方程為 I (μA)= -0.16+0.019c (μ mol? L-1)，R=0.996.根據(jù)線性回歸分析中的LINEST函數(shù)，檢測(cè)限=3.3SD/S，SD為回歸線性方程中I的標(biāo)準(zhǔn)偏差（0.11），S為回歸線性方程的斜率（0.16），求得檢測(cè)限為2.06 μmol? L-1.

圖3 Mb-AG/GCE檢測(cè)2,4-DCP的I—t曲線和濃度與電流的線性圖

2.2 2,4-DCP與Mb作用的紫外光譜研究

在200～700 nm范圍內(nèi)記錄Mb的紫外-可見光譜（見圖4曲線a）.Mb在可見光區(qū)409 nm處有一個(gè)特征峰，這是蛋白質(zhì)中血紅素的吸收峰：在紫外區(qū)有2個(gè)特征峰：210 nm和280 nm，這是蛋白質(zhì)肽鏈中氨基酸殘基π－π躍遷的結(jié)果.2,4-DCP在可見光區(qū)沒有吸收，但在紫外光區(qū)有2個(gè)吸收峰，分別在230 nm和290 nm（圖4曲線c）.當(dāng)向Mb溶液中加入2,4-DCP時(shí)，Mb紫外區(qū)的2個(gè)特征峰稍微紅移至226 nm和285 nm，峰吸收加強(qiáng)（圖4曲線b）.Mb紫外光區(qū)光譜特征峰位置的變化，說明2,4-DCP與Mb氨基酸殘基之間存在強(qiáng)烈的作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化[10].Mb可見光區(qū)的光譜特征峰位置（409 nm）沒有改變，但吸收強(qiáng)度減小（插圖），且隨著2,4-DCP濃度的增加，峰吸收逐漸減小，這說明2,4-DCP沒有影響血紅素所處的微環(huán)境，而是在氧氣存在下，Mb與2,4-DCP發(fā)生了氧化還原反應(yīng)，使血紅素Fe(III)/Fe(II)的價(jià)態(tài)發(fā)生了改變.

圖4 2,4-DCP與Mb作用的紫外可見光譜圖

3 結(jié)論

用瓊脂糖水凝膠固定在電極的Mb具有細(xì)胞色素P450的活性.在無氧的溶液中，2,4-DCP與Mb的作用，表現(xiàn)為血紅素Fe(III)/Fe(II)的氧化還原電位隨2,4-DCP濃度的增加而負(fù)移，峰電流基本不變，說明2,4-DCP與Mb中的血紅素形成了配合物，但并沒有催化反應(yīng)產(chǎn)生.在氧氣飽和的溶液中，2,4-DCP與Mb的作用，表現(xiàn)為血紅素Fe Fe(III)/Fe(II)的氧化還原電位處，增加2,4-DCP濃度，陰極峰電流增大，這是Mb具有P450單加氧酶活性催化2,4-DCP羥基化的結(jié)果，因此固定化的Mb具有細(xì)胞色素P450的活性.下一步將結(jié)合GC-MS確定該反應(yīng)中的產(chǎn)物，研究Mb催化2,4-DCP的機(jī)理.

[1]CZAPLICKA M.Sources and transformations of chlorophenols in the natural environment[J].Sci Total Environ, 2004,322：21-39.

[2]URETA-ZANARTU M S,BUSTOS P,BERRIOS C,et al.Electrooxidation of 2,4-dichlorophenol and other polychlorinated phenols at a glassy carbon electrode[J].Electrochimica Acta,2002,47：2399-2406.

[3]WANG Hui,WANG Jinlong.Electrochemical degradation of 2,4-dichlorophenol on a palladium modified gas-diffusion electrode[J].Electrochimica Acta,2008,53：6402-6409.

[4]OZSOZ M,ERDEM A,OZKAN D,et al.Clay/Sol-Gel-modified electrodes for the selective electrochemical monitoring of 2,4-dichlorophenol[J].Langmuir,2003,19：4728-4732.

[5]MEHMOOD Z,KELLY D E,KELLY S L.Cytochrome P4503A4 mediated metabolism of 2,4-dichlorophenol[J]. Chemosphere,1997,34：2281-2291.

[6]劉慧宏，萬永清，鄒國林.固定化肌紅蛋白的氧化還原反應(yīng)和類酶活性[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)：理學(xué)版，2006, 52(4)：461-465.

[7]RUSLING J F,NASSAR A E F.Enhanced electron transfer for myoglobin in surfactant films on electrodes[J].J Am Chem Soc,1993,115：11891-11897.

[8]LIU Songqin,PENG Lei,YANG Xiaodi,et al.Electrochemistry of cytochrome P450 enzyme on nanoparticlecontaining membrane-coated electrode and its applications for drug sensing[J].Anal Biochem,2008,375：209-216.

[9]HENDRICKS N R,WARYO T T,AROTIBA O,et al.Microsomal cytochrome P450-3A4(CYP3A4) nanobiosensor for the determination of 2,4-dichlorophenol：An endocrine disruptor compound[J].Electrochim Acta,2009,54：1925-1931.

[10]ZHOU Jiahong,WU Xiaohong,GU Xiaotian,et al.Spectroscopic studies on the interaction of hypocrellin A and hemoglobin[J].Spectrochimica Acta：Part A,2009,72：151-155.

The Interaction between 2,4-Dichlorophenol and Myoglobin

LIU Hua-jun1,Wang Li-ping1,LIU Hui-hong2
(1.School of Chemical Engineering&Food Science,Xiangfan University,Xiangfan 441053, China;2.School of Chemistry&Chemical Engineering,Wuhan Textile University, Wuhan 430073,China)

2,4-Dichlorophenol(2,4-DCP)is a pollutant associated with the occurrence of cancer in humans.The interactions between 2,4-DCP and myoglobin immobilized by agarose hydrogel on the surface of glassy carbon electrode were explored by cyclic voltammetry.2,4-DCP coordinated with the heme of myoglobin without occurrence of catalytic reaction in the deoxygen solution.However,an increase in the bioelectrocatalytic reduction current was observed after 2,4-DCP addition to the solution in the aerobic condition,which indicated that myoglobin functioned as cytochrome P450 in the catalytic pathways of C-hydroxylation of 2,4-DCP.The catalytic current against the 2,4-DCP concentration is a linear relationship in the range of 12.5-208 μmol? L-1.The limit of detection is calculated to be 2.06 μmol? L-1.UV spectrum suggested that 2,4-DCP interacts with the amino-acid residues of myoglobin.The decrease of absorption peak located at 409 nm with the addition of 2,4-DCP also confirmed the occurrence of catalytic reactions.

2,4-Dichlorophenol;myoglobin;cytochrome P450

?

Q51

A

1006-7302（2011）03-0023-05

2011-04-23

湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2008CDB014）；湖北省教育廳重大項(xiàng)目（Z20092501）

劉華俊（1963—），男，湖北棗陽人，副教授，博士，主要研究方向?yàn)樯镫娀瘜W(xué).