劉 婕 李金茹 牛文彥

肥胖導(dǎo)致2型糖尿病，肥胖者脂肪組織增生先于血管生成，造成脂肪組織缺氧。缺氧的脂肪組織吸引巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，脂肪細(xì)胞及浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞又可釋放炎癥因子，造成脂肪組織自身的胰島素抵抗以及其他組織的胰島素抵抗[1]。骨骼肌是胰島素作用的主要靶組織，攝取大部分餐后升高的血糖，此作用主要由細(xì)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4（GLUT4）完成[2]。胰島素刺激GLUT4從胞漿轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上，轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞。本研究應(yīng)用本課題組已建立的過表達(dá)myc的C2C12小鼠骨骼肌細(xì)胞株（C2C12GLUT 4myc）[3]，用常氧或缺氧培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞條件培基（Conditioned medium,CM）孵育C2C12GLUT4myc細(xì)胞，檢測(cè)并比較它們對(duì)胰島素調(diào)節(jié)GLUT4myc轉(zhuǎn)位作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 Raw 264.7巨噬細(xì)胞株由加拿大多倫多病童醫(yī)院研究所Amira Klip教授饋贈(zèng)，C2C12GLUT4myc骨骼肌細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室建立。Hanks液、DMEM（天潤(rùn)善達(dá)公司），胎牛血清（以色列Bioind公司），馬血清（美國(guó)Gibco公司），Blastici?din-HCL（德國(guó)Calbiochem公司），胰島素（加拿大Eli Lilly公司），抗myc抗體（美國(guó)Sigma公司），偶聯(lián)辣根過氧化物酶（HRP）的山羊抗兔抗體（美國(guó)Jackson Immuno Research公司），增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物檢測(cè)試劑盒（美國(guó)PerkinElmer公司），小鼠腫瘤壞死因子（TNF）-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（北京四正柏生物科技有限工司），Trizol、cDNA合成試劑盒、Premix Ex Taq酶、TaqDNA聚合酶、dNTP Mixture、熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒（Takara寶生物工程公司），引物合成（北京奧科生物技術(shù)公司）。

1.2 方法

1.2.1 骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)C2C12GLUT4myc成肌細(xì)胞，將成肌細(xì)胞接種到24孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞密度達(dá)100%時(shí)，再用含5%馬血清的DMEM高糖培養(yǎng)基將其誘導(dǎo)分化為多核肌管，每2 d換液，于第5天用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 巨噬細(xì)胞條件培基提取 用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培養(yǎng)Raw 264.7巨噬細(xì)胞，按1×106/mL密度接種細(xì)胞于培養(yǎng)皿。于接種第3天，待細(xì)胞密度達(dá)90%時(shí)，更換為用于培養(yǎng)C2C12肌管的培養(yǎng)基，將細(xì)胞分為常氧組和缺氧組，缺氧組置于37℃，1%O2，5%CO2，94%N2下孵育，4 h后分別提取常氧培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基（CM-Nor）和缺氧培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基（CM-Hypo），離心取上清后孵育骨骼肌細(xì)胞。

1.2.3 免疫印跡檢測(cè)GLUT1的表達(dá) 常氧或缺氧培養(yǎng)巨噬細(xì)胞后，裂解細(xì)胞，測(cè)蛋白后取40 mg裂解液，37℃加熱30 min，7.5%SDS-PAGE電泳，免疫印跡檢測(cè)GLUT1，一抗用抗GLUT1的兔抗體，二抗用偶聯(lián)HRP的山羊抗兔抗體，以Ac?tinin 1作為內(nèi)參，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物試劑盒檢測(cè)，曝光，應(yīng)用NIH Image J軟件分析定量。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組 本研究分3組：對(duì)照組為常規(guī)培養(yǎng)基，常氧組為常氧培養(yǎng)提取的巨噬細(xì)胞條件培基，缺氧組為缺氧培養(yǎng)提取的巨噬細(xì)胞條件培基，分別用這3種培養(yǎng)基孵育C2C12GLUT4myc細(xì)胞16 h。每組再分為胰島素處理組和未處理組，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)9次。

1.2.5 偶聯(lián)抗體吸光度分析法測(cè)定細(xì)胞膜上GLUT4myc的含量 處理細(xì)胞后，分別加或不加100 nmol/L胰島素孵育20 min，用PBS洗，3%多聚甲醛固定，0.1 mol/L的甘氨酸淬火，5%脫脂牛奶封閉，再用抗myc抗體孵育1 h，用偶聯(lián)過氧化物酶HRP的山羊抗兔IgG孵育1 h，加入底物鄰苯二胺溶液，反應(yīng)約10 min后終止，取上清液加入96孔板，用酶標(biāo)儀在492 nm波長(zhǎng)下測(cè)定上清液吸光度值，結(jié)果表示為相對(duì)于對(duì)照組中未加胰島素組的倍數(shù)。

1.2.6 Real-time PCR測(cè)定巨噬細(xì)胞TNF-α mRNA水平 提取總RNA，取2 μg合成cDNA第一鏈，取2 μg cDNA產(chǎn)物及相應(yīng)上下游引物加入12.5 mL SYBR?Premix Ex TaqTM（2×）體系內(nèi)擴(kuò)增,條件為95℃30 s，95℃5 s，57℃10 s，72℃34 s，40個(gè)循環(huán)，β-actin為內(nèi)參。TNF-α上游引物為5′-CGTCGTAG CAAACCACCAA-3′；下游引物為5′-GAGAACCTGGGAGTA GACAAGG-3′。β-actin上游引物為5′-GGCTGTATTCCCCTC CATCG-3′；下游引物為5′-CCAGTTGGTAACAATGCCAT GT-3′。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.2.7 ELISA法檢測(cè)巨噬細(xì)胞條件培基中TNF-α含量 將標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品各100 mL加入酶標(biāo)板中，37℃孵育90 min，洗滌，加生物素化抗體，37℃孵育30 min，洗板，加入酶結(jié)合物，37℃孵育30 min，洗板，加入顯色劑，反應(yīng)約10 min后終止，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算TNF-α的濃度。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。2組間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；多組間比較采用One-way ANOVA方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧巨噬細(xì)胞GLUT1的表達(dá) 與常氧培養(yǎng)組相比，巨噬細(xì)胞缺氧培養(yǎng)后GLUT1蛋白表達(dá)升高為常氧組的（3.83±0.62）倍，表明缺氧培養(yǎng)成功，見圖1。

圖1 缺氧巨噬細(xì)胞GLUT1表達(dá)

2.2 巨噬細(xì)胞條件培基對(duì)胰島素刺激的GLUT4myc轉(zhuǎn)位的影響 常氧組和缺氧組胰島素刺激的GLUT4myc轉(zhuǎn)位增加的倍數(shù)均低于對(duì)照組（均P＜0.01），但常氧組和缺氧組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基可直接造成骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗，缺氧組并不比常氧組加重胰島素抵抗，見表1。

2.3 巨噬細(xì)胞TNF-α mRNA的表達(dá) 測(cè)得巨噬細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)量為相對(duì)值，常氧培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)為1.00±0.00，而缺氧培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)為常氧培養(yǎng)組的（1.46± 0.20）倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.654，P＜0.001）。2.4 巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α水平 測(cè)得巨噬細(xì)胞TNF-α表達(dá)量為相對(duì)值，常氧培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞TNF-α表達(dá)量為1.00±0.00，缺氧培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞條件培基中TNF-α為常氧培養(yǎng)組的（1.78±0.24）倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.501，P=0.043）。

表1 巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)C2C12GLUT4myc細(xì)胞GLUT4myc轉(zhuǎn)位的影響 （±s）

表1 巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)C2C12GLUT4myc細(xì)胞GLUT4myc轉(zhuǎn)位的影響 （±s）

＊P＜0.05

組別 n 胰島素刺激GLUT4轉(zhuǎn)位的倍數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理組比 P對(duì)照組（1）常氧組（2）缺氧組（3）F 999 1.61±0.27 1.30±0.18 1.32±0.13 6.557＊（1）∶（2）（1）∶（3）（2）∶（3）0.003 0.006 0.808

3 討論

肥胖是2型糖尿病一個(gè)重要的危險(xiǎn)因素，肥胖可造成脂肪組織缺氧，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，使脂肪組織處于慢性炎癥狀態(tài)，并使其分泌大量的炎性因子，導(dǎo)致脂肪組織胰島素抵抗[4]。進(jìn)入血液的炎性因子可影響胰島素對(duì)其他組織的作用，脂肪組織分泌的炎性因子主要由浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生[5]。體外缺氧培養(yǎng)正常C57BL/6小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎性因子的基因表達(dá)顯著上調(diào)[1]。

筆者用1%O2孵育巨噬細(xì)胞，通過檢測(cè)缺氧應(yīng)答基因GLUT1表達(dá)的上調(diào)確定缺氧培養(yǎng)成功。通過檢測(cè)C2C12GLUT4myc細(xì)胞膜上GLUT4myc數(shù)量變化（轉(zhuǎn)位）可分析細(xì)胞攝取葡萄糖的變化[3]。本研究發(fā)現(xiàn)CM-Nor和CM-Hypo均增加基礎(chǔ)狀態(tài)下（未加胰島素）GLUT4myc的轉(zhuǎn)位，而不影響胰島素作用下的GLUT4myc轉(zhuǎn)位，導(dǎo)致胰島素刺激的GLUT4myc轉(zhuǎn)位增加的倍數(shù)低于對(duì)照組，表明CM直接造成骨骼肌胰島素抵抗，推測(cè)CM中的炎性因子削弱了胰島素作用。

TNF-α是巨噬細(xì)胞分泌的重要炎性因子，用TNF-α體外直接孵育骨骼肌細(xì)胞可以導(dǎo)致胰島素抵抗[6]。本研究進(jìn)一步測(cè)定常氧和缺氧培養(yǎng)后巨噬細(xì)胞的TNF-α mRNA和蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)缺氧培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞TNF-α mRNA和蛋白表達(dá)均高于常氧培養(yǎng)組，但未發(fā)現(xiàn)兩者造成的骨骼肌胰島素抵抗程度存在差異。其原因可能是由于脂肪組織脂解增強(qiáng)，分泌游離脂肪酸增多。巨噬細(xì)胞分泌的炎性因子如TNF-α可能通過促進(jìn)脂解作用，在全身胰島素抵抗中發(fā)揮作用[7]。缺氧的脂肪組織招募巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，并促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌大量的炎性因子。單獨(dú)缺氧培養(yǎng)巨噬細(xì)胞盡管能上調(diào)TNF-α的表達(dá)，但升高的TNF-α不足以造成更嚴(yán)重的胰島素抵抗。本課題組待發(fā)表的研究發(fā)現(xiàn)缺氧培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞條件培養(yǎng)基比常氧的脂肪細(xì)胞條件培養(yǎng)基造成更嚴(yán)重的骨骼肌胰島素抵抗，并吸引更多的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。后續(xù)的研究應(yīng)將脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共同缺氧培養(yǎng)，檢測(cè)兩者相互作用是否能分泌更多的炎性因子或脂肪酸，從而比單獨(dú)缺氧培養(yǎng)一種細(xì)胞造成更嚴(yán)重的骨骼肌胰島素抵抗。

綜上所述，巨噬細(xì)胞的CM-Nor和CM-Hypo造成C2C12GLUT4myc骨骼肌細(xì)胞GLUT4myc轉(zhuǎn)位的胰島素抵抗，表明炎性因子削弱胰島素作用，但缺氧上調(diào)的TNF-α不足以造成更嚴(yán)重的胰島素抵抗。

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