付 曉 朱夢(mèng)瑜 高星杰 錢寶鑫 王保亞 趙 虹 葛 林 楊 潔

人類Tudor-SN（tudor staphylococcal nuclease）蛋白，又稱為p100蛋白、SND1（staphylococcal nuclease domain containing 1），首次作為EB病毒細(xì)胞核抗原2（Epstein-Barr virus nuclear protein 2，EBNA2）的轉(zhuǎn)錄調(diào)控激活因子被發(fā)現(xiàn)[1]。Callebaut等[2]運(yùn)用疏水簇結(jié)構(gòu)分析（hydrophobic cluster analysis，HCA）發(fā)現(xiàn)人類Tudor-SN蛋白由N端4個(gè)重復(fù)葡萄球菌核酸酶樣（staphylococcal nucleases-like，SN-like）的SN（1～4）結(jié)構(gòu)域及C端的Tudor-SN 5（TSN）結(jié)構(gòu)域組成。本研究采用能夠表達(dá)紅色熒光蛋白（red fluorescent protein，RFP）的pERFP-C1質(zhì)粒載體，構(gòu)建pER?FP-C1-hTudor-SN-SN(1～4)重組質(zhì)粒，在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)帶紅色熒光標(biāo)簽的Tudor-SN蛋白SN（1～4）各功能片段，從而為深入研究Tudor-SN蛋白SN結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)功能提供便利工具。

1 材料與方法

1.1 材料 真核表達(dá)質(zhì)粒pSG5-Tudor-SN-flag、pERFP-C1-Tudor-SN，大腸桿菌DH5α及HeLa細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及T4 DNA連接酶均購(gòu)自Fer?mentas公司，Taq酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，T/A載體（pTZ57R/T）購(gòu)自大連Takara生物工程公司，B型小量DNA快速回收試劑盒購(gòu)自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司，質(zhì)粒快速小提試劑盒購(gòu)自北京索來(lái)寶科技有限公司，去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司，Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司。倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olym?pus公司，顯微數(shù)碼攝影機(jī)購(gòu)自日本Nikon公司，引物由北京六合通公司合成，基因測(cè)序工作由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 目的片段的獲取 參照質(zhì)粒快速小提試劑盒內(nèi)說(shuō)明書提取pSG5-Tudor-SN-flag質(zhì)粒DNA。根據(jù)Tudor-SN的SN（1～4）結(jié)構(gòu)域序列設(shè)計(jì)含有EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物序列，見表1。以pSG5-Tudor-SN-flag質(zhì)粒DNA為模板，PCR擴(kuò)增SN（1～4）各片段，條件為95℃預(yù)變性5 min,95℃30 s,55℃45 s,72℃3 min共33個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外燈下切割含有目的條帶的凝膠塊，利用凝膠回收試劑盒進(jìn)行目的片段回收，在T4 DNA連接酶作用下，與T/A載體22℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α，在含有氨芐的LB平板上篩選克隆。挑取陽(yáng)性克隆，搖菌擴(kuò)增并提取質(zhì)粒。以EcoRⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，凝膠回收試劑盒回收并純化各目的片段。

表1 Tudor-SN的SN(1～4)功能片段引物序列

1.2.2 線性pERFP-C1的獲取 采用pERFP-C1質(zhì)粒載體，見圖1。以質(zhì)粒快速小提試劑盒提取pERFP-C1-Tudor-SN質(zhì)粒DNA，采用EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切pERFP-C1-Tudor-SN質(zhì)粒，完整切下線性pERFP-C1質(zhì)粒載體，瓊脂糖電泳。凝膠回收試劑盒回收得到約4 700 bp線性pERFP-C1。

1.2.3 重組真核表達(dá)質(zhì)粒pERFP-C1-Tudor-SN-SN（1～4）的構(gòu)建 在T4 DNA連接酶作用下，將線性pERFP-C1質(zhì)粒載體與具有相同黏性末端的Tudor-SN各功能片段SN(1～4)進(jìn)行22℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌大腸桿菌DH5α，在含有卡那霉素的LB平板上篩選克隆。挑取陽(yáng)性克隆，搖菌擴(kuò)增并提取重組質(zhì)粒。

圖1 pERFP-C1質(zhì)粒圖譜

1.2.4 單、雙酶切及基因測(cè)序鑒定 用EcoRⅠ和BamHⅠ對(duì)重組質(zhì)粒pERFP-C1-Tudor-SN-SN（1～4）進(jìn)行單、雙酶切，并以1.5%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證片段的大小。同時(shí)，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行基因測(cè)序鑒定。

1.2.5 HeLa細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及熒光顯微鏡觀察 以去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取無(wú)內(nèi)毒素重組質(zhì)粒。HeLa細(xì)胞接種至10 mm培養(yǎng)皿中，置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞80%匯合時(shí)，依據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h，在倒置熒光顯微鏡下觀察pERFP-C1-Tudor-SN-SN（1～4）的表達(dá)并以顯微數(shù)碼攝影機(jī)拍照。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增目的片段 以pSG5-Tudor-SN-flag為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再以1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，結(jié)果在500 bp左右觀察到與目的片段長(zhǎng)度相符的熒光條帶，見圖2。

圖2 目的片段SN（1～4）的獲取

2.2 線性pERFP-C1質(zhì)粒載體的獲取 采用EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切pERFP-C1-Tudor-SN質(zhì)粒，切下完整的線性pERFP-C1質(zhì)粒載體，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在4 700 bp左右出現(xiàn)條帶，見圖3，純化回收后用于后續(xù)的連接反應(yīng)。

圖3 線性pERFP-C1質(zhì)粒載體的獲取

2.3 重組真核表達(dá)質(zhì)粒pERFP-C1-Tudor-SN-SN（1～4）的鑒定

2.3.1 單、雙酶切及測(cè)序鑒定 將構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別進(jìn)行EcoRⅠ和BamHⅠ的單、雙酶切，產(chǎn)生的條帶大小與預(yù)期相符，見圖4，重組質(zhì)?；驕y(cè)序結(jié)果正確，證明Tudor-SN-SN（1～4）各功能片段已成功插入到pERFP-C1的多克隆位點(diǎn)上。

圖4 pERFP-C1-Tudor-SN-SN（1～4）的單、雙酶切鑒定圖

2.3.2 熒光顯微鏡下觀察重組質(zhì)粒的表達(dá) 在10 mm培養(yǎng)皿上接種HeLa細(xì)胞，脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pER?FP-C1-Tudor-SN-SN（1～4），培養(yǎng)48 h后，熒光顯微鏡下可見紅色熒光蛋白R(shí)FP-Tudor-SN-SN（1～4）的表達(dá)，見圖5。

3 討論

本研究所采用的pERFP-C1是將pEGFP-C1載體中編碼綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的基因替換為櫻桃紅色熒光蛋白（cher?ry-RFP）基因后得到的一種真核質(zhì)粒載體，其多克隆位點(diǎn)（multiple cloning site,MCS）位于RFP序列和SV40 polyA之間。插入到MCS的目的基因如果與RFP基因的閱讀框一致，就可以與RFP的C末端融合表達(dá)，且目的蛋白的生物學(xué)活性通常不受影響。重組真核紅色熒光質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后并不干擾細(xì)胞的生長(zhǎng)，還可根據(jù)紅色熒光信號(hào)來(lái)定位示蹤目的蛋白，故該質(zhì)粒可用于活細(xì)胞狀態(tài)下目的基因表達(dá)的觀察、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率的鑒定及蛋白間結(jié)合關(guān)系的研究等。

圖5 熒光顯微鏡下觀察重組質(zhì)粒的表達(dá)（×40）

真核基因表達(dá)是一個(gè)精細(xì)復(fù)雜的過(guò)程，包括基因轉(zhuǎn)錄、pre-mRNA剪接、mRNA翻譯等步驟。基因轉(zhuǎn)錄和pre-mRNA剪接并非2個(gè)獨(dú)立的的過(guò)程，常通過(guò)某些特定蛋白的作用而緊密相聯(lián)[3]。人類Tu?dor-SN蛋白就是一種可偶聯(lián)調(diào)控轉(zhuǎn)錄和剪接過(guò)程的多功能蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，Tudor-SN蛋白作為一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，借助其N端重復(fù)的SN結(jié)構(gòu)域與c-Myb[4],STAT6[5],STAT5[6]等多種啟動(dòng)子特異轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用。本研究將Tudor-SN蛋白的SN（1～4）基因序列成功插入到pERFP-C1質(zhì)粒中，構(gòu)建針對(duì)SN結(jié)構(gòu)域的紅色熒光重組質(zhì)粒，其可與特定轉(zhuǎn)錄因子的綠色熒光重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞，通過(guò)共聚焦顯微鏡技術(shù)進(jìn)行共定位分析，將有助于進(jìn)一步研究Tudor-SN蛋白不同SN片段在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。

葡萄球菌核酸酶又稱為耐熱核酸酶，是一種Ca2+依賴酶，可水解單/雙鏈DNA和RNA的5-磷酸二酯鍵，生成3-單核苷酸和多核苷酸，其催化能力主要依賴于其氨基酸序列中的2個(gè)活化位點(diǎn)[7]。人類Tudor-SN蛋白的SN結(jié)構(gòu)域雖與葡萄球菌核酸酶相似，卻未發(fā)現(xiàn)此活化位點(diǎn)，推測(cè)其可能沒有催化DNA的能力[8]。然而，Tudor-SN蛋白SN結(jié)構(gòu)中的第一個(gè)亞結(jié)構(gòu)域（98個(gè)氨基酸）卻含有可識(shí)別多種核苷酸的保守OB折疊結(jié)構(gòu)（oligonucleotide/oligosac?charide-binding fold，寡聚核苷/寡聚糖結(jié)合折疊）[2]，提示Tudor-SN蛋白的SN結(jié)構(gòu)域雖沒有核酸酶的催化位點(diǎn)，但仍有可能與核酸結(jié)合。本研究成功進(jìn)行了Tudor-SN蛋白不同SN結(jié)構(gòu)域的紅色熒光標(biāo)記，有助于深入探討該多功能蛋白在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、核酸代謝及相關(guān)疾病發(fā)生中的作用。

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