張文娟 于丹妮 韓育植 任志明

齲病是影響人類健康的三大疾病之一，其主要致病菌是變異鏈球菌(Streptococcus mutans，S.mu?tans,以下簡稱變鏈菌)。變鏈菌是牙菌斑生物膜的重要組成成分，在人類口腔中占有重要的生態(tài)地位。對變鏈菌致齲機制尤其是對其致病因子的研究一直是口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點。HtrA（high tempera?ture requirement A）蛋白是一種熱休克誘導(dǎo)的絲氨酸蛋白酶，它具有分子伴侶和蛋白酶的雙重功能，其主要的作用是幫助細(xì)菌在高溫、低pH值和氧化應(yīng)激等不良環(huán)境下生長。在革蘭陽性菌中，HtrA蛋白參與了許多具有致病性的表面蛋白的合成[1-2]，而且HtrA蛋白已被證明是肺炎鏈球菌的毒力因子[3]。因此，HtrA蛋白可能在變鏈菌的致齲過程中發(fā)揮著重要的作用。本研究擬構(gòu)建HtrA蛋白編碼基因htrA缺失的變鏈菌突變株，為進(jìn)一步明確HtrA蛋白在變鏈菌致齲過程中的作用機制提供實驗菌株。

1 材料與方法

1.1 材料 變鏈菌國際標(biāo)準(zhǔn)株UA159（Ingbritt，血清C型），購自四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)中心；含卡那霉素（Km）抗性基因的質(zhì)粒pUC4ΩKm2由美國馬里蘭大學(xué)Kevin McIver教授惠贈；質(zhì)粒pCrePA由美國堪薩斯大學(xué)Indranil Biswas教授惠贈；pGEM-T-Easy TA載體和T4 DNA連接酶（Promega北京）；大腸桿菌DH5α由本實驗室保存；氨芐青霉素、卡那霉素、紅霉素粉劑（中國藥品生物制品檢定所標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品）；T4 DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶BaeⅠ和PflMⅠ（NEB公司）；細(xì)菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、小量膠回收試劑盒（Biomiga）；Taq PCR Master Mix試劑盒、pfu PCR Master Mix試劑盒、DNA分子質(zhì)量MarkerⅢ、Marker DL15000、MarkerⅦ（天根，北京）；TSA瓊脂平板、TPY液體培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基由本實驗室配制。所有引物均由上海生工生物公司合成；DNA測序由華大基因（北京）公司完成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng) -20℃保存的變鏈菌國際標(biāo)準(zhǔn)株于常溫下復(fù)蘇，接種于胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）固體平板，于37℃厭氧條件下（85%N2、10%H2、5%CO2）培養(yǎng)24 h，形態(tài)學(xué)和生化鑒定后挑取單個菌落接種于10 mL TPY液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)24 h增菌。含質(zhì)粒的大腸桿菌接種于LB平板或液體培養(yǎng)基中于37℃恒溫?fù)u床中孵育。

1.2.2 PCR擴增目的基因 （1）采用細(xì)菌基因組提取試劑盒，按試劑盒說明提取變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA。使用紫外分光光度計測定所提變鏈菌基因組DNA的濃度和純度，純度用比值A(chǔ)260/A280表示（A為吸光度），1%瓊脂糖凝膠電泳80 V，40 min檢測其分子質(zhì)量大小，置-20℃保存?zhèn)溆?。?）以變鏈菌基因組DNA為模板，與引物P1（5-gactagcattatttggaattttctcatc?gg-3）和P2（5-gaggtgagatatgaagacaacttcgttgac-3），進(jìn)行PCR擴增包含整個htrA基因在內(nèi)的1.9 kb的DNA片段。PCR反應(yīng)條件為94℃5 min，94℃1 min，53℃1 min，72℃1 min，72℃15 min，共30個循環(huán)。以質(zhì)粒pUC4ΩKm2為模板，PCR擴增Km抗性基因，引物為loxP-Km-F(5-cgATAACTTCGTATA?ATGTATGCTATACGAAGTTATgaggatgaagaggatgaggaggcag-3，大寫字母為loxP位點）和loxP-Km-R（5-cgATAACTTCG?TATAGCATACATTATACGAAGTTATgctttttagacatctaaatctagg-3），PCR反應(yīng)條件為94℃5 min，94℃30 s，52℃30 s，72℃1 min，72℃10 min，共30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物分別用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，采用小量膠回收試劑盒純化回收。

1.2.3 htrA基因片段克隆到pGEM-T-Easy TA載體 將擴增的htrA基因片段連接入pGEM-T-Easy TA克隆載體內(nèi)，采用T4 DNA連接酶于4℃過夜，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將菌液涂布于氨芐青霉素（100 mg/L)抗性的LB平板上，37℃培養(yǎng)，過夜，挑取陽性克隆增菌后提取質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒pGEM-T-htrA，NotⅠ酶切鑒定。

1.2.4 Km抗性基因盒（loxP-Km-loxP）替換htrA基因的部分序列 采用限制性內(nèi)切酶BaeⅠ、PflMⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pGEM-T-htrA（該酶切位點均在htrA基因內(nèi)），并采用T4 DNA聚合酶使末端平齊化，1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠，純化回收分子質(zhì)量較大的片段。采用T4 DNA連接酶于4℃過夜，將大片段與loxP-Km-loxP連接，連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將菌液涂布于氨芐青霉素和Km(50 mg/L)抗性的LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性菌株增菌后提取質(zhì)粒，得到htrA基因缺失的同源重組載體pIB△htrA-Km，NotⅠ酶切及DNA測序鑒定。

1.2.5 帶Km抗性的htrA基因缺陷株的構(gòu)建 采用限制性內(nèi)切酶NotⅠ酶切質(zhì)粒pIB△htrA-Km，1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠純化回收小片段，并將該小片段電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株，將菌液涂布于Km（300 mg/L）抗性的TSA平板上37℃厭氧培養(yǎng)48 h，挑取陽性菌株于TPY培養(yǎng)液中增菌后提取基因組DNA,利用引物對P3（5-aataacgaaggtcaaatcagaa-3）和P4（5-atatctttagtattaagatatt-3）進(jìn)行PCR鑒定，并以標(biāo)準(zhǔn)株為對照。

1.2.6 Cre重組酶介導(dǎo)的Km抗性基因的刪除 將Cre重組酶表達(dá)質(zhì)粒pCrePA電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的帶Km抗性的htrA基因缺陷株，將菌液涂布于含紅霉素（Em，10 mg/L）的TSA平板上，30℃過夜培養(yǎng)，篩選得到陽性轉(zhuǎn)化株。再將陽性轉(zhuǎn)化株平行接種于含Em、Km的TSA平板和只含Em的TSA平板，30℃培養(yǎng)48 h，篩選出Em抗性、Km敏感的菌株。將該菌株平行接種于含Em的TSA平板和不含抗生素的TSA平板，37℃過夜培養(yǎng)，篩選得到Em敏感的菌株。選擇10個菌株，利用引物對P3/P4進(jìn)行PCR分析及DNA測序鑒定，鑒定出的突變株即為無標(biāo)記的htrA基因缺陷株。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物的分子質(zhì)量鑒定 本研究以變鏈菌國際標(biāo)準(zhǔn)株全基因組DNA為模板擴增出的包含基因htrA的DNA片段大小約為1.9 kb，Km抗性片段大小約為1.5 kb，見圖1。未見非特異性擴增及拖尾現(xiàn)象，分子質(zhì)量大小與預(yù)計大小相同。

圖1 PCR擴增片段瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 重組質(zhì)粒pGEM-T-htrA的酶切鑒定 采用限制性內(nèi)切酶NotⅠ酶切重組質(zhì)粒pGEM-T-htrA后（htrA基因克隆位點兩側(cè)均有NotⅠ酶切位點），1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果可見2條各為3.0 kb和1.9 kb的條帶，分別與空載體和擴增片段的預(yù)期大小一致，見圖2。

圖2 pGEM-T-htrA NotⅠ酶切瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 htrA基因缺失的同源重組載體pIB△htrA-Km的鑒定 限制性內(nèi)切酶BaeⅠ和PflMⅠ雙酶切pGEM-T-htrA（BaeⅠ和PflMⅠ酶切位點都位于htrA基因內(nèi)），得到大片段4 108 bp和小片段818 bp，見圖3，大片段與loxP-Km-loxP連接轉(zhuǎn)化后，含目的質(zhì)粒的大腸桿菌可在含有Km的LB培養(yǎng)基內(nèi)生長良好，證明Km基因正確表達(dá)，大片段與loxP-Km-loxP正確連接。NotⅠ酶切載體pIB△htrA-Km后，1%瓊脂糖凝膠電泳可見2條帶分別為2 981 bp和2 627 bp，與預(yù)期大小一致，見圖4。DNA測序結(jié)果與已獲得的預(yù)期序列比較，未見堿基突變的發(fā)生，說明同源重組載體構(gòu)建成功。

圖3 pGEM-T-htrA雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖

2.4 帶Km抗性的htrA基因缺陷株的鑒定 質(zhì)粒pIB△htrA-Km的小片段電轉(zhuǎn)化變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株后，篩選出的菌株可在含Km的TSA及TPY培養(yǎng)基中生長較好，說明Km抗性基因正確重組到變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株的基因組中，并正確表達(dá)。PCR鑒定結(jié)果，見圖5，標(biāo)準(zhǔn)株擴增片段為2 250 bp，帶Km抗性的htrA基因缺陷株擴增片段為2 932 bp，條帶單一清楚，分子質(zhì)量大小與預(yù)期大小相符。

圖4 pIB△htrA-Km NotⅠ酶切瓊脂糖凝膠電泳圖

圖5 標(biāo)準(zhǔn)株與突變株P(guān)CR擴增片段瓊脂糖凝膠電泳圖

2.5 無標(biāo)記的htrA基因缺陷株的鑒定 與變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株和帶Km抗性的htrA基因缺陷株相比，選擇的10個菌株中有2個菌株P(guān)CR擴增的條帶大小為1 500 bp,與預(yù)期大小一致，見圖6。DNA測序顯示htrA基因部分序列已被刪除，并無Km抗性基因，該位點只留有一個loxP位點。

圖6 無標(biāo)記突變株P(guān)CR擴增片段瓊脂糖凝膠電泳圖

3 討論

變鏈菌要在口腔環(huán)境中生存定植，必須適應(yīng)復(fù)雜多變的口腔環(huán)境。這需要多種蛋白酶的參與，其中重要的一種是HtrA蛋白。HtrA蛋白是絲氨酸蛋白酶家族成員，在細(xì)菌的耐熱特性中發(fā)揮著重要的作用，當(dāng)環(huán)境溫度升高時，它可參與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)異常蛋白的降解[1-2]。在革蘭陽性菌中，HtrA蛋白在細(xì)菌的致病過程中發(fā)揮了重要作用。對肺炎鏈球菌的研究表明，HtrA蛋白的編碼基因htrA缺失時，3種重要的毒力因子PspA、NanA和LytA的表達(dá)均顯著下降[4]。在金黃色葡萄球菌中，htrA基因缺失后可影響較多致病因子的分泌和表達(dá)[5]。

在變鏈菌中，有7種不同的細(xì)胞外或細(xì)胞壁相關(guān)蛋白的表達(dá)皆受htrA基因的調(diào)控[6]。Biswas等[7]認(rèn)為，HtrA蛋白可影響變鏈菌糖酵解有關(guān)的細(xì)胞外酶，從而進(jìn)一步影響變鏈菌生物膜的形成能力，最終影響變鏈菌的致齲能力。為了更好地研究變鏈菌中HtrA蛋白的生物學(xué)功能及其致齲機制，本研究利用雙交換同源重組原理，使loxP-Km-loxP替換htrA基因內(nèi)的部分序列，成功構(gòu)建出htrA基因缺陷株。在這種框內(nèi)缺失突變株的構(gòu)建中，抗性基因盒的存在可因抗性的獲得而易于選擇。但是，這些基因盒帶有異源基因（抗性標(biāo)記），如果這些標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于選擇轉(zhuǎn)化子，它們可能會產(chǎn)生無法預(yù)知的有害影響[8]。因此，本研究利用Cre/loxP位點特異性重組系統(tǒng)刪除Km抗性標(biāo)記。

Cre/loxP重組系統(tǒng)是一種有力的DNA重組工具。它來源于噬菌體P1，由Cre重組酶和loxP位點2部分組成。Cre重組酶屬于位點專一性重組酶的整合酶家族。loxP位點是一種典型的回文序列結(jié)構(gòu)，長34 bp，包括兩側(cè)的2個13 bp的反向重復(fù)序列和中間的8 bp的非對稱間隔序列。Cre重組酶識別并結(jié)合兩側(cè)的13 bp反向重復(fù)序列并介導(dǎo)中間的8 bp間隔區(qū)發(fā)生重組，它不需要任何宿主輔助因子和輔助蛋白[9]。在Cre酶的介導(dǎo)下，當(dāng)2個loxP位點位于同一個分子上且方向相同時，loxP位點之間的DNA片段可被刪除，只留下一個loxP位點[10]。

本研究利用Cre/loxP系統(tǒng)的刪除基因的原理，通過設(shè)計引物PCR擴增將2個同向的loxP位點錨定在Km抗性基因的兩端，構(gòu)建出Km抗性基因盒l(wèi)oxP-Km-loxP，為Km抗性基因的刪除做好準(zhǔn)備。另外，cre基因的表達(dá)質(zhì)粒需具有2個重要的特點：（1）含有一個抗性基因作為篩選標(biāo)記。（2）含有一個熱敏復(fù)制子，以利于消除cre表達(dá)質(zhì)粒。本研究使用質(zhì)粒pCrePA，它含有Em抗性基因和熱敏復(fù)制子pWV01[11]，其允許、限制溫度分別是30℃和37℃。pCrePA電轉(zhuǎn)化變鏈菌后，30℃培養(yǎng)，Em抗性篩選出轉(zhuǎn)化株，Cre重組酶表達(dá)并刪除Km抗性基因；37℃培養(yǎng)，pCrePA不能復(fù)制，因而被消除。

最后DNA測序證明本研究成功構(gòu)建出無標(biāo)記的htrA基因缺失的變鏈菌突變株，為進(jìn)一步研究htrA基因的功能，明確HtrA蛋白在變鏈菌致齲中的調(diào)控作用及分子機制奠定了實驗基礎(chǔ)。目前關(guān)于變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株和突變株的相關(guān)功能差異研究正在進(jìn)行中。

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