陳 浩, 胡梁斌, 唐春平, 胡 健, 石志琦*
(1.揚(yáng)州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,揚(yáng)州 225009; 2.江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗室培育基地,農(nóng)業(yè)部食品安全監(jiān)控重點(diǎn)開放實(shí)驗室,南京 210014;3.河南科技學(xué)院食品學(xué)院,新鄉(xiāng) 453003)
葡萄霜霉病是由葡萄霜霉病菌[Pl asmopar a viticol a (Ber k.et Curtis.)Berl.et de Toni.]引起的一種世界性病害,所有種植葡萄的區(qū)域都有發(fā)生,嚴(yán)重危害葡萄的葉片和嫩梢,影響樹勢和產(chǎn)量。生產(chǎn)上防治霜霉病及卵菌綱的常用化學(xué)藥劑苯基酰胺類(phenyla mides,如甲霜靈等),氨基甲酸酯類(carba mate,如霜霉威等),甲氧基丙烯酸酯類(str obil urins,如嘧菌酯等),嗎啉類(morpholine,如烯酰嗎啉等)均已存在不同程度的抗藥性[1-5],同時導(dǎo)致農(nóng)藥殘留,環(huán)境污染等問題。近年來國家引導(dǎo)和鼓勵農(nóng)藥研制向綠色環(huán)保方向發(fā)展,因此研究生物防治技術(shù)有著現(xiàn)實(shí)意義。
B-FS01是江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院從感染油菜菌核病菌的油菜莖稈上分離得到的1株廣譜性拮抗菌,經(jīng)鑒定為枯草芽胞桿菌(Bacill us subtilis)。對其抗菌物質(zhì)分離純化,經(jīng)分析為fengycins和surf actins脂肽類抗菌物質(zhì)。此類抗菌物質(zhì)屬于細(xì)菌分泌的非核糖體合成多肽,組成中包括一些非蛋白質(zhì)源的氨基酸甚至一些其他的化合物,結(jié)構(gòu)上往往是環(huán)化的,這種特殊的結(jié)構(gòu)有利于它們特定功能的穩(wěn)定和發(fā)揮。非核糖體合成多肽中應(yīng)用較廣泛的有青霉素、萬古霉素、放線菌素 D 等[6-8]。
芽胞桿菌包括枯草芽胞桿菌因其自身能產(chǎn)生耐熱、抗紫外線等抗逆的內(nèi)生孢子和穩(wěn)定的抗菌物質(zhì),容易在環(huán)境中長時間存活,成為土壤及其他環(huán)境中的優(yōu)勢微生物菌群,所以是常用的生防菌篩選對象[9-10],被作為防治對化學(xué)藥劑產(chǎn)生抗性病原菌的方法之一[11],許多已被成功應(yīng)用于生物防治中[12-14]。在前期試驗中已經(jīng)確定 B-FS01牛肉膏蛋白胨發(fā)酵液對葡萄霜霉病菌有一定的效果,本文進(jìn)一步將B-FS01發(fā)酵液制成了一種可濕性粉劑,并明確了B-FS01對葡萄霜霉病的實(shí)際防治效果。
枯草芽胞桿菌菌株B-FS01由油菜莖稈分離獲得,目前已委托中國微生物菌種保藏中心保藏(保藏號1233);72%霜脲氰·錳鋅可濕性粉劑,上海杜邦農(nóng)化有限公司生產(chǎn);十二烷基磺酸鈉,白炭黑等,江蘇省蘇科農(nóng)化有限責(zé)任公司提供;小型氣流粉碎機(jī)。
因葡萄霜霉病菌只能活體培養(yǎng),故采用葉盤保濕法[15-16]測定B-FS01對葡萄霜霉病菌的室內(nèi)抑制活性。試驗設(shè)6個處理,B-FS01牛肉膏蛋白胨發(fā)酵液(30℃,120 r/min培養(yǎng)72 h,菌體含量2.6×109個/mL)無菌水稀釋成菌體含量105、106、107個/mL,B-FS01無菌濾液(發(fā)酵液過0.22μm細(xì)菌過濾器),72%霜脲氰·錳鋅可濕性粉劑600倍稀釋液,無菌水對照。從江蘇省南京市江心洲精品果園采集發(fā)病葉片和新梢第4~6輪未發(fā)病葉片(感病品種‘紅寶石’),裝入保鮮袋帶回實(shí)驗室。發(fā)病葉片保濕活體培養(yǎng)24 h,用4℃蒸餾水洗下病菌孢子囊,配成懸浮液(孢子囊濃度控制為1×106個/mL),4℃下存放備用。未發(fā)病葉片在葉脈間用打孔器制成直徑1 c m的葉盤,分別置于含有不同處理的藥液中浸泡1 min,然后葉背面朝上分別擺放于與浸泡葉盤相同濃度藥液潤濕的吸水紙上,將配制好的孢子囊懸浮液10μL接種于葉盤中央。每處理1個培養(yǎng)皿,每培養(yǎng)皿20個葉盤,重復(fù)4次。置于光暗12 h交替,22℃下培養(yǎng),7 d后觀察結(jié)果。根據(jù)病斑面積占葉盤面積的百分比劃分病級:0級,無病斑;1級,1%~20%;2級,21%~50%;3級,>50%。計算病情指數(shù)和抑制率。
參考韋松等方法[17],先將B-FS01牛肉膏蛋白胨發(fā)酵液(菌體含量2.6×109個/mL)與分散劑木質(zhì)素磺酸鈉(6%),潤濕劑十二烷基磺酸鈉(4%)、穩(wěn)定劑磷酸氫二鉀(4%)混合均勻,再與填料白炭黑按質(zhì)量比7∶3比例吸附混合,自然晾干后經(jīng)氣流粉碎(細(xì)度:98%以上<0.043 mm)制得枯草芽胞桿菌B-FS01可濕性粉劑(活菌體數(shù)不少于109個/g)。
試驗選在江蘇省南京市江心洲精品果園內(nèi)進(jìn)行,品種為‘紅寶石’(感病品種),常規(guī)栽培措施管理。試驗按農(nóng)業(yè)部藥檢所田間試驗準(zhǔn)則設(shè)計[18],共5個處理:B-FS01可濕性粉劑用清水稀釋成菌體含量105、106、107個/mL,72%霜脲氰·錳鋅可濕性粉劑600倍稀釋液,清水對照。采用噴霧法施藥,在下午16:00后進(jìn)行,避開高溫時間。每處理10株,4次重復(fù),隨機(jī)區(qū)組設(shè)計。每小區(qū)隨機(jī)調(diào)查10個當(dāng)年抽生新蔓,自上而下調(diào)查10片葉,記錄各級病葉數(shù)。葉片分級標(biāo)準(zhǔn):0級,無病斑;1級:病斑面積占整個葉面積的5%以下;3級:病斑面積占整個葉面積的6%~25%;5級:病斑面積占整個葉面積的26%~50%;7級:病斑面積占整個葉面積的51%~75%;9級:病斑面積占整個葉面積的75%以上。保護(hù)作用:在田間有零星發(fā)病時開始施藥(試驗植株無發(fā)病葉片)。2010年7月6日第1次施藥;7月13日第2次施藥;7月20日第3次施藥;7月27日調(diào)查藥后病指。治療作用:在田間普遍開始發(fā)病時施藥,7月13日藥前調(diào)查病指,第1次施藥;7月20日第2次施藥;7月27日第3次施藥;8月3日調(diào)查藥后病指。試驗期間平均溫度28℃,降水量280 mm。
病情指數(shù)=(∑(各級病葉數(shù)×相對級數(shù)值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×級數(shù)最高值))×100;抑制率/防效(%)=[1-(對照區(qū)藥前病指×處理區(qū)藥后病指)/(對照區(qū)藥后病指×處理區(qū)藥前病指)]×100或=[(對照區(qū)病指-處理區(qū)病指)/對照區(qū)病指]×100。差異顯著性比較采用鄧肯氏新復(fù)極差法(DMRT)檢驗(p<0.05)[18]。
從表1中可看出,B-FS01發(fā)酵液菌體含量為2.6×107個/mL對葡萄霜霉病菌抑制率達(dá)到了82.48%,與對照藥劑72%霜脲氰·錳鋅可濕性粉劑600倍稀釋液(83.41%)相當(dāng),顯著優(yōu)于其他處理;B-FS01無菌濾液的抑制率(68.88%)與B-FS01發(fā)酵液菌體含量2.6×106個/mL的抑制率(73.27%)無顯著差異;B-FS01發(fā)酵液菌體含量2.6×105個/mL的抑制率(57.59%)最低,顯著低于其他處理。
表1 B-FS01對葡萄霜霉病菌室內(nèi)抑制活性1)
用血球計數(shù)板計數(shù),隨機(jī)取樣重復(fù)5次,取菌體平均值109個/g為有效菌體濃度;細(xì)度98%以上,粒徑小于0.043 mm;潤濕時間2 min42 s;懸浮率76.5%;含水量3.1%;p H5.8~6.9。以上各項可濕性粉劑物理性能測定方法參照中國農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)匯編[19]。
從表2中可看出,3次藥后防效,B-FS01可濕性粉劑稀釋液菌體含量107個/mL無論在保護(hù)作用還是治療作用中均表現(xiàn)出對葡萄霜霉病的優(yōu)良防效,分別為88.25%和80.88%,與對照藥劑72%霜脲氰·錳鋅可濕性粉劑600倍稀釋液無顯著性差異,且在保護(hù)作用中防效明顯優(yōu)于72%霜脲氰·錳鋅可濕性粉劑600倍液,也優(yōu)于自身在治療作用中的防效。B-FS01可濕粉劑稀釋液菌體含量106個/mL在保護(hù)作用中的防效為75.94%,與對照藥劑72%霜脲氰·錳鋅可濕性粉劑600倍液無顯著性差異,但在治療作用中效果較差,為63.21%;B-FS01可濕性粉劑稀釋液菌體含量105個/mL在保護(hù)作用和治療作用中防效均顯著低于對照藥劑72%霜脲氰·錳鋅可濕性粉劑600倍液和B-FS01可濕性粉劑菌體含量106、107個菌體/mL的防效,分別為61.52%和51.27%。試驗未發(fā)現(xiàn)B-FS01可濕性粉劑稀釋液對植株和果實(shí)有不良影響。
表2 B-FS01可濕性粉劑對葡萄霜霉病田間藥效
芽胞桿菌作為生防菌已有大量的研究報道,但用于防治作物霜霉病的研究較少,能夠開發(fā)成制劑在田間實(shí)際應(yīng)用并有較好穩(wěn)定防效的則更是鮮有報道。本試驗室篩選到的拮抗菌B-FS01無論在室內(nèi)還是在田間,對葡萄霜霉病均具有優(yōu)良的防效,已初步開發(fā)成了制劑,正在準(zhǔn)備農(nóng)藥登記方面的工作。
霜霉病是田間比較難防治的一種病害,B-FS01對葡萄霜霉病防效較好的原因可能是:首先B-FS01可產(chǎn)生廣譜的脂肽類抗生素surfactins和fengycins(包括fengycins A、fengycins B和一種新型的fengycins),它們能夠?qū)ι锬ぎa(chǎn)生類似除垢劑的作用[20-22]。這些脂肽類抗生素分子量一般在2 ku以下,可透過細(xì)菌過濾器,所以B-FS01無菌濾液同樣具有很好的抑菌活性,但顯然在實(shí)際應(yīng)用中直接使用B-FS01抗菌物質(zhì)是不經(jīng)濟(jì)且不一定有好的效果的辦法,而使用活菌制劑則是相對可行的方法。利用芽胞桿菌本身抗逆特性,可以保證菌體長時間在田間復(fù)雜環(huán)境下存活,同時也能持續(xù)分泌廣譜抗菌物質(zhì),對植株上的其他病原菌可能起到抑制作用,達(dá)到穩(wěn)定有效防治病害的目的。
其次B-FS01在植株葉片上的“生態(tài)占位”作用:B-FS01先于病菌在葉面上定殖,優(yōu)先取得空間、營養(yǎng)等,從而抑制病原菌的發(fā)展,所以在室內(nèi)試驗中采用先藥劑處理后接孢子囊的方法,在田間試驗結(jié)果中也可以看出保護(hù)作用要明顯好于治療作用。本次試驗期間田間氣候不是很利于霜霉病的發(fā)生,下一步還應(yīng)明確在氣候適宜、病害嚴(yán)重發(fā)生的情況下(如保護(hù)地內(nèi))B-FS01對霜霉病的防效。
細(xì)菌發(fā)酵液在儲存使用過程中存在很多問題,如二次發(fā)酵,生長后期菌體衰老,抑菌活性降低,不利運(yùn)輸,使用不便等。作者對B-FS01發(fā)酵液進(jìn)行了初步劑型開發(fā),各項指標(biāo)基本達(dá)到了可濕性粉劑的工業(yè)指標(biāo),但在以后的工廠化生產(chǎn)中還應(yīng)考慮原料的成本問題。
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