明 佳,李 濤,徐 競,楊光明,張 瑗,劉良明

（第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所第二研究室/創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶400042）

血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelium cell,VEC）是襯覆于血管腔面的單層鱗狀上皮細(xì)胞,它除了具有屏障功能和參與物質(zhì)交換的功能外,還具有活躍的代謝和內(nèi)分泌功能,特別是它合成、釋放的血管舒張和收縮因子,與神經(jīng)、體液因子一起,共同參與了全身血管張力的維持和調(diào)節(jié)?？p隙連接是存在于相鄰細(xì)胞間的一種膜通道結(jié)構(gòu)[1],VEC和血管平滑肌細(xì)胞間存在著縫隙連接,即肌-內(nèi)皮縫隙連接（myo-endothelial gap junction,M EGJ）,M EGJ可以穿過血管內(nèi)彈力層,使VEC和血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)行雙向性的、直接的電化學(xué)交流[2-3],參與了血管緊張性的調(diào)節(jié)?？p隙連接的基本組成單位是連接蛋白（connexin,Cx）,VEC同時(shí)表達(dá)Cx37、Cx40和Cx43[4]；血管平滑肌細(xì)胞協(xié)同表達(dá)Cx37、Cx40、Cx43和Cx45[4]。

嚴(yán)重休克失代償期常出現(xiàn)血管低反應(yīng)性,其主要表現(xiàn)為全身血管對舒/縮血管物質(zhì)的反應(yīng)減弱或不反應(yīng),目前對其發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚。本研究的前期研究發(fā)現(xiàn),Cx40、Cx43通過cAM P-PKA、cGMP-PKG、DG-PKC信號(hào)通路參與了休克后內(nèi)膜依賴的血管收縮反應(yīng)性的調(diào)節(jié)[5]。具體表現(xiàn)在：Cx40可以增加血管cAMP、cGMP的濃度和蛋白激酶A（PKA）、蛋白激酶C（PKG）的活性,降低二酰甘油（DG）的濃度、蛋白激酶C（PKC）的活性和血管內(nèi)膜依賴的收縮反應(yīng)性；Cx43可以降低血管cAM P、cGMP的濃度和PKA、PKG的活性,增加DG的濃度、PKC的活性和血管內(nèi)膜依賴的收縮反應(yīng)性。但是，Cx40/43是如何通過PKA、PKG、PKC參與了血管鈣敏感性和收縮反應(yīng)性的調(diào)節(jié)目前尚不清楚,也未見相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M休克缺氧損害,以SD大鼠的腸系膜上動(dòng)脈（superior mesenteric artery,SMA）為研究對象,以Cx40/43的反義寡脫氧核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide,AODN）阻斷SMA的Cx40/43表達(dá),在此基礎(chǔ)上觀察PKA、PKG、PKC的特異性激動(dòng)劑和拮抗劑對不同程度缺氧SMA的肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase,MLCK）、肌球蛋白輕鏈磷酸酶（myosin light chain phosphotase,M LCP）活性和內(nèi)膜依賴的收縮反應(yīng)性的影響,希望通過本研究探索M EGJ調(diào)節(jié)失血性休克后血管收縮反應(yīng)性的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本的制備 Sprague Dawley大鼠[SD大鼠,體質(zhì)量（270±10）g,雌雄不限]購于第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所動(dòng)物中心。主要藥品：8-Br-cAMP、8-Br-cGMP、PM A、H-89、KT-5823、staurosporine、楊梅黃酮（myricetin）、乙酰膽堿（acetylcholine,Ach）均購自美國Sigma公司。主要儀器：恒溫離體器官灌流浴槽購自西班牙Leitca Scientific Instruments公司,肌張力換能器及八道生理記錄儀購自澳大利亞AD Instrument公司。

按照文獻(xiàn)[6]的方法,無菌條件下取正常 SD大鼠的SM A,制成SMA血管環(huán),隨機(jī)分為常氧組、缺氧1h組和缺氧3h組,每組又分為對照亞組、Cx40/43AODN處理亞組、Cx40/43AODN聯(lián)合蛋白激酶激動(dòng)劑處理亞組、Cx40/43AODN聯(lián)合蛋白激酶抑制劑處理亞組,每組8根血管或血管環(huán)。蛋白激酶激動(dòng)劑分別為8-Br-cAMP（10-6mol/L,PKA激動(dòng)劑）、8-Br-cGMP（10-4mol/L,PKG激動(dòng)劑）、PMA（10-7mol/L,PKC激動(dòng)劑）；蛋白激酶抑制劑分別為 H-89（10-6mol/L,PKA抑制劑）、KT-5823（10-6mol/L,PKG抑制劑）、staurosporine（10-7nmol/L,PKC抑制劑）。

將SMA血管環(huán)進(jìn)行Cx40/43AODN轉(zhuǎn)染、不同程度缺氧[5]、分別與 PKA、PKG、PKC特異性激動(dòng)劑或拮抗劑孵育10min后,檢測血管對楊梅黃酮（myricetin,內(nèi)膜依賴性的血管收縮劑[7],工作濃度10-4mol/L）的收縮反應(yīng)；另一部分血管在與10-4mol/L的 myricetin孵育 30min后,用于 M LCP、MLKC活性的檢測。

1.2 內(nèi)膜依賴的血管收縮反應(yīng)性的測定 將轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染Cx40/43AODN、常氧或缺氧處理的 SMA環(huán)懸掛于注有Krebs-Henseleit重碳酸鹽緩沖液[8-9]的離體器官灌流浴槽中,支架與肌張力換能器相連,按文獻(xiàn)[8-9]的方法37℃孵育2h,待張力曲線平穩(wěn)后,分別加入 8-Br-cAMP（10-6mol/L）、8-Br-cGMP（10-4mol/L）、PM A（10-7mol/L）、H-89（10-6mol/L）、K T-5823（10-6mol/L）、staurosporine（10-7nmol/L）孵育 10min后,加入 myricetin（10-4mol/L）觀察SM A收縮力的變化。血管收縮力（g/mg）=加myricetin后血管環(huán)收縮力的增加值（g）/血管環(huán)質(zhì)量（mg）。為了檢測血管內(nèi)膜的完整性,以去甲腎上腺素（終濃度為10-6mol/L）誘導(dǎo)血管環(huán)收縮至穩(wěn)定的平臺(tái)期后,加入終濃度為10-6mol/L的二酰膽堿（Ach）,以血管環(huán)舒張程度（%）評(píng)價(jià)血管舒張反應(yīng)性,舒張程度超過70%表示血管內(nèi)膜完整[10],本實(shí)驗(yàn)用的血管環(huán)均在舒張程度大于75%的條件下進(jìn)行。血管環(huán)舒張程度（%）=（加Ach后血管張力的下降幅度/加去甲腎上腺素后血管張力的上升幅度）×100%。

1.3 M LCP活性測定 按常規(guī)方法提取血管總蛋白,取10μ L蛋白加入240μ L蛋白稀釋液（T ris-HCl 25mmol/L,乙二胺四乙酸（EDTA）0.1mmol/L,0.1%β-巰基乙醇）混勻,取40μ L加入10μ L磷酸化myosin,25℃反應(yīng)15min；以5%三氯乙酸100μ L、5mg/mL牛血清清蛋白25μ L終止反應(yīng)；13000×g離心3min；取100μ L反應(yīng)混合液進(jìn)行液閃計(jì)數(shù)測定cpm值。同時(shí)取10μ L磷酸化myosin測定cpm值,以從磷酸化Myosin脫去的iP表示M LCP活性。

1.4 M LCK活性測定 按常規(guī)方法提取血管總蛋白,取30μ L蛋白加入60μ L酶反應(yīng)緩沖液（T ris-HCl 30mmol/L pH7.4,KCl 50mmol/L,MgCl21mmol/L,4-硝基苯磷酸二鈉（PNPP）60mg/mL,PKA抑制劑0.2mg/mL,[γ-32P]-A TP 0.2mmol/L,CaCl21mmol/L,CaM 50μ g/mL,myosin 2mg/mL）,混勻,25℃反應(yīng)3min；加5%三氯醋酸液10μ L終止反應(yīng)；吸取20μ L反應(yīng)液進(jìn)行液閃計(jì)數(shù)測定cpm值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),統(tǒng)計(jì)結(jié)果以±s表示,各組間均數(shù)比較行ANOVA方差分析和Post hoc檢驗(yàn)（S-N-K/LSD）,自身均數(shù)比較行配對t檢驗(yàn),相關(guān)性分析采用Pearson correlation檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PKA、PKG、PKC對Cx40/43AODN調(diào)節(jié)缺氧血管內(nèi)膜依賴的收縮反應(yīng)性的影響 與常氧組的對照亞組比較,缺氧1h組血管對myricetin的收縮反應(yīng)性明顯升高；缺氧3h組則明顯降低。Cx40AODN可以明顯增加血管的收縮反應(yīng)性；Cx43AODN可以明顯降低血管的收縮反應(yīng)性。8-Br-cAMP、8-BrcGMP和staurosporine可以部分或完全拮抗Cx40AODN的作用,增強(qiáng)Cx43AODN的作用,明顯降低Cx40/43AODN處理血管的收縮反應(yīng)性；H-89、KT-5823和PMA可以部分或完全拮抗Cx43AODN的作用,增強(qiáng)Cx40AODN的作用,明顯增加Cx40/43AODN處理血管的收縮反應(yīng)性（圖1）。

圖1 PKA、PKG、PKC對Cx40/43AODN調(diào)節(jié)缺氧血管收縮反應(yīng)性的影響

2.2 PKA、PKG、PKC對Cx40/43AODN調(diào)節(jié)缺氧血管M LCP活性的影響 與常氧組的對照亞組比較,缺氧1h組M L-CP活性明顯降低,缺氧3h組血管的M LCP活性明顯升高。Cx40AODN可以明顯降低血管的MLCP活性；Cx43AODN可以明顯升高血管的MLCP活性。8-Br-cAM P、8-Br-cGMP和staurosporine可以部分或完全拮抗Cx40AODN的作用,加強(qiáng)Cx43AODN的作用,明顯增加Cx40/43AODN處理血管的MLCP活性；H-89、KT-5823和PMA可以加強(qiáng)Cx40AODN的作用,拮抗Cx43AODN的作用,明顯降低Cx40/43AODN處理血管的MLCP活性（圖2）。

圖2 PKA、PKG、PKC對Cx40/43AODN調(diào)節(jié)缺氧血管M LCP活性的影響

2.3 PKA、PKG、PKC對 Cx40/43AODN調(diào)節(jié)缺氧血管MLCK活性的影響 缺氧1h組血管的M LCK活性較常氧組的對照亞組明顯升高（P＜0.01）,缺氧3h組M LCK活性明顯降低,myricetin、Cx40/43AODN對各組血管M LCK活性無明顯影響（圖3）。

圖3 Cx40/43AODN對缺氧處理血管M LCK活性的影響

3 討論

嚴(yán)重休克失代償期常出現(xiàn)血管低反應(yīng)性,其主要表現(xiàn)為全身血管對舒/縮血管物質(zhì)的反應(yīng)減弱或不反應(yīng),目前認(rèn)為其發(fā)生機(jī)制主要與血管平滑肌細(xì)胞膜上的腎上腺素能受體失敏、細(xì)胞膜超極化和血管平滑肌細(xì)胞對鈣的敏感性降低等三大因素有關(guān)[11]。但是,應(yīng)用一氧化氮合酶抑制劑（如L-硝基精氨酸甲酯）[12]、KATP抑制劑（如格列本脲）[13]、以及鈣增敏劑（如血管緊張素-Ⅱ）[11]只能部分恢復(fù)而不能完全逆轉(zhuǎn)休克血管的反應(yīng)性。前期研究發(fā)現(xiàn),VEC通過Cx40/43參與了休克血管MLCP活性和MLC20磷酸化水平的調(diào)節(jié),進(jìn)而參與了對失血性休克后SMA內(nèi)膜依賴的收縮反應(yīng)性的調(diào)節(jié)[6]。

本實(shí)驗(yàn)采用離體血管環(huán)研究發(fā)現(xiàn),因缺氧時(shí)間不同,血管的MLCP活性和收縮反應(yīng)性發(fā)生不同變化：缺氧1h的血管處于高收縮反應(yīng)期,血管的MLCP活性降低；缺氧3h的血管處于收縮低反應(yīng)期,血管的 M LCP活性增加。myricetin和Cx40AODN可以降低正常血管和缺氧血管的M LCP活性,增加內(nèi)膜依賴的血管收縮反應(yīng)性；Cx43AODN可以增加血管的MLCP活性,抑制血管內(nèi)膜依賴的收縮反應(yīng)性。有研究表明,肌球蛋白是一種由肌動(dòng)蛋白激活的Mg2+-ATP酶,其分子由2條重鏈和4條輕鏈組成,2條重鏈的氨基酸末端分別含有一個(gè)ATP水解部位和一個(gè)肌動(dòng)蛋白結(jié)合位點(diǎn),4條輕鏈分別為2條調(diào)節(jié)輕鏈（20kD）和 2條必需輕鏈（17kD）,M LC20受MLCK/M LCP催化發(fā)生磷酸化/脫磷酸化。外界刺激通過形成Ca2+-鈣調(diào)蛋白（calmodulin,CaM）復(fù)合物激活MLCK,后者可以磷酸化M LC20,導(dǎo)致平滑肌收縮,此為M LC20磷酸化的鈣依賴性途徑；外界刺激通過抑制MLCP的活性,使M LC20去磷酸化作用減弱而導(dǎo)致血管收縮的途徑為非鈣依賴性途徑。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,myricetin、Cx40/43AODN對缺氧血管MLCK活性無明顯影響,Cx40/43可能通過調(diào)節(jié)MLCP活性的非鈣依賴途徑調(diào)節(jié)休克后SMA內(nèi)膜依賴的收縮反應(yīng)性。

作者的前期研究發(fā)現(xiàn),Cx40、Cx43通過 cAMP-PKA、cGMP-PKG、DG-PKC信號(hào)通路參與了休克后內(nèi)膜依賴的血管收縮反應(yīng)性的調(diào)節(jié)[7]。具體表現(xiàn)在：Cx40可以增加血管cAM P、cGMP的濃度和PKA、PKG的活性,降低DG的濃度、PKC的活性和血管內(nèi)膜依賴的收縮反應(yīng)性；Cx43可以降低血管cAMP、cGMP的濃度和PKA、PKG的活性,增加DG的濃度、PKC的活性和血管內(nèi)膜依賴的收縮反應(yīng)性。本研究發(fā)現(xiàn)，myricetin和Cx40/43AODN對M LCP和血管收縮反應(yīng)性的作用受 PKA、PKG、PKC的調(diào)節(jié),具體表現(xiàn)為 8-Br-cAMP、8-Br-cGM P和staurosporine可以明顯增加Cx40/43AODN處理血管的M LCP活性,明顯降低Cx40/43AODN處理血管的收縮反應(yīng)性；用H-89、KT-5823和PMA拮抗PKA、PKG,激活PKC后可以明顯降低Cx40/43AODN處理血管的MLCP活性,明顯增加Cx40/43AODN處理血管的收縮反應(yīng)性。說明Cx40抑制血管內(nèi)膜依賴的收縮反應(yīng)性與其降低PKC活性、增加PKA和PKG活性、進(jìn)一步通過后者調(diào)節(jié)MLCP的活性有關(guān)；Cx43促進(jìn)血管內(nèi)膜依賴的收縮反應(yīng)性的機(jī)制與其增加PKC活性、抑制PKA和PKG活性、進(jìn)而調(diào)節(jié)MLCP的活性有關(guān)。

綜上所述,Cx40/43可能通過PKA、PKG、PKC信號(hào)通路調(diào)節(jié)血管M LCP的活性,進(jìn)而參與了休克血管鈣敏感性和血管內(nèi)膜依賴的收縮反應(yīng)性的調(diào)節(jié),但是Cx40/43調(diào)節(jié)PKA、PKG、PKC及M LCP的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的深入研究。

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