田永斌， 夏明明， 邵 晨

(浙江師范大學(xué)生態(tài)學(xué)研究所，浙江金華 321004)

虎紋蛙(Hoplobatrachus rugulosus)曾廣泛分布于我國南方各省，由于其個(gè)體大、肉味鮮美、營養(yǎng)豐富，是一種很好的食用蛙，多年來一直遭到過度捕捉，再加上生境退化及農(nóng)藥濫用等因素的影響［1］，虎紋蛙的野生資源急劇減少．為了滿足市場(chǎng)需求及保護(hù)自然資源，人們開展了虎紋蛙的人工養(yǎng)殖，并取得了一定的成效．然而，目前虎紋蛙的人工養(yǎng)殖存在一些問題，對(duì)虎紋蛙種質(zhì)資源質(zhì)量存在著較大的隱患．

保護(hù)種質(zhì)資源已經(jīng)成為當(dāng)今世界一股強(qiáng)勁的潮流．為保護(hù)和持續(xù)利用種質(zhì)資源，迫切要求種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的建立．本文從形態(tài)學(xué)水平、細(xì)胞學(xué)水平、生化和分子遺傳學(xué)水平等層面對(duì)虎紋蛙資源的研究狀況進(jìn)行了總結(jié)與探討，并對(duì)虎紋蛙的養(yǎng)殖狀況及存在的問題進(jìn)行了分析，為虎紋蛙種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)、資源保護(hù)措施及持續(xù)發(fā)展我國虎紋蛙養(yǎng)殖業(yè)相關(guān)措施的制定與進(jìn)一步研究提供參考資料．

1 中國虎紋蛙分類地位、分布及資源現(xiàn)狀

1．1 分類地位及分布

虎紋蛙，俗稱水雞、田雞、青雞、泥蛙、蝦蟆等，隸屬于脊索動(dòng)物門(Chordata)脊椎動(dòng)物亞門(Vertebrata)兩棲綱(Amphibia)無尾目(Anura)叉舌蛙科(Dicroglossidae)虎紋蛙屬(Hoplobatrachus)．虎紋蛙屬約有 H．crassus，H．occipitalis，H．rugulosus和 H．tigerinus 4個(gè)(亞)種，中國和泰國各有1種，即中國虎紋蛙(H．rugulosus)和泰國虎紋蛙(H．occipitalis)．

中國虎紋蛙的分布范圍較廣，我國河南、陜西、四川、云南、貴州、湖北、安徽、江蘇、浙江、江西、湖南、福建、臺(tái)灣、廣東、海南、廣西和香港等地均有分布，國外還見于緬甸、泰國、越南和馬來西亞等地區(qū)［2］．

1．2 資源現(xiàn)狀

1989年，虎紋蛙被列為國家Ⅱ級(jí)保護(hù)動(dòng)物，受到國家法律的保護(hù)，同時(shí)也是唯一列入國家重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物名錄的蛙類;1996年，虎紋蛙被列入中國紅皮書等級(jí);1997年，虎紋蛙被列入華盛頓公約(CITES)瀕危等級(jí)，附錄2;2003年，虎紋蛙又被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國際貿(mào)易公約》附錄Ⅱ珍稀瀕危物種名錄中;2004年，虎紋蛙被列入《中國物種紅色名錄》易危物種等級(jí)．

虎紋蛙曾廣泛分布于我國華東、華南、華中和西南等地區(qū)［3］，但近年來一部分地區(qū)已不見野生虎紋蛙的蹤影［4］．由于棲息地被破壞及過度捕捉，虎紋蛙野生資源遭到嚴(yán)重破壞，其數(shù)量正呈不斷下降的趨勢(shì)［5］．

目前，虎紋蛙分布范圍及種質(zhì)資源不斷萎縮，資源狀況不明．所以，對(duì)不同地理種群現(xiàn)有虎紋蛙資源的野外調(diào)查，將會(huì)為科學(xué)評(píng)估虎紋蛙資源現(xiàn)狀，從而制定相應(yīng)的保護(hù)措施提供寶貴信息;另外，也為進(jìn)一步的虎紋蛙種質(zhì)研究和資源利用積累豐富的材料．

2 虎紋蛙種質(zhì)資源研究進(jìn)展

2．1 形態(tài)學(xué)研究

形態(tài)學(xué)標(biāo)記是傳統(tǒng)的研究物種差異的分類方法，主要是根據(jù)生物體形態(tài)特征的差異進(jìn)行物種的劃分．

而虎紋蛙的形態(tài)學(xué)研究只有少數(shù)報(bào)道．邵晨等［6］對(duì)浙江金華繁殖期虎紋蛙的部分形態(tài)特征進(jìn)行過簡單的描述;林植華等［7］對(duì)浙江麗水地區(qū)虎紋蛙的11個(gè)指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)量，并對(duì)雌雄差異進(jìn)行了研究分析，結(jié)果表明虎紋蛙頭長、四肢、眼徑、耳徑等特征存在一定的兩性異形現(xiàn)象，其中最顯著的兩性異形特征是體長．

形態(tài)學(xué)研究方法簡單直觀，容易觀察記錄，長期以來物種的分類及資源鑒定都是以形態(tài)標(biāo)記為主要的或初步的指標(biāo)．所以，對(duì)于中國虎紋蛙各地理種群的形態(tài)學(xué)研究還有待開展．但是，不同的學(xué)者選擇不同的形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)量分析，可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)同一物種的分析結(jié)果不一致．而且，形態(tài)和表型特征易受環(huán)境條件、人為因素、測(cè)量工具及基因顯隱性等因素的影響，并不能完全真實(shí)全面地反映物種的遺傳多樣性．因此，要更加準(zhǔn)確、細(xì)致地了解種群的遺傳變異狀況，還必須結(jié)合細(xì)胞、生化及分子水平等方面的分析和研究．

2．2 細(xì)胞遺傳學(xué)研究

細(xì)胞學(xué)標(biāo)記主要是指染色體核型(染色體數(shù)目、大小、隨體、著絲點(diǎn)位置等)及帶型(C帶、G帶、N帶等)．其中染色體組型(核型)的研究是細(xì)胞遺傳學(xué)的基礎(chǔ)，是分類和系統(tǒng)發(fā)生研究較為有力的遺傳學(xué)證據(jù)，并具有物種的特異性．所以，一直以來關(guān)于無尾兩棲類細(xì)胞遺傳學(xué)研究的大部分集中于染色體組型的研究［8-14］．

我國關(guān)于虎紋蛙組型的研究主要集中在20世紀(jì)80年代．張維道［15-16］采用骨髓細(xì)胞滴片法和5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)對(duì)安徽蕪湖地區(qū)虎紋蛙的染色體組型進(jìn)行了研究，并對(duì)虎紋蛙G-帶進(jìn)行了初步分析，研究發(fā)現(xiàn):蕪湖產(chǎn)虎紋蛙二倍體染色體為26(2n=26)，包括5對(duì)大型染色體和8對(duì)小型染色體，其中包括8對(duì)中著絲粒染色體和5對(duì)亞中著絲粒染色體;在No．6，No．8的長臂和No．2的短臂上具有次縊痕．李樹深等［17］報(bào)道云南蒙自地區(qū)虎紋蛙核型是2n=26(22 M+4 SM)，可分為2大組:1～5對(duì)為A組，屬大型染色體;6～13對(duì)為B組，屬小型染色體;No．3和No．6為亞中央著絲點(diǎn)染色體，其余均為中央著絲點(diǎn)染色體;No．6的長臂近著絲點(diǎn)區(qū)域有次縊痕．章菊明等［18］、劉楚吾等［19］和方玲等［20］分別對(duì)浙江溫州地區(qū)、湖南漢壽地區(qū)和廣西南寧地區(qū)的虎紋蛙進(jìn)行了染色體組型研究，與李樹森的分析結(jié)果相似．

文獻(xiàn)［21］指出，次縊痕的位置、數(shù)目和相對(duì)長度是染色體的分類特征之一．通過對(duì)上述學(xué)者對(duì)安徽蕪湖、云南蒙自、浙江溫州、湖南漢壽及廣西南寧5個(gè)地區(qū)虎紋蛙染色體組型的研究進(jìn)行比較分析，我們發(fā)現(xiàn)各地理種群虎紋蛙染色體的相對(duì)長度、臂比指數(shù)、次縊痕的數(shù)目和分布及亞中著絲粒染色體的多少都存在一定的差異性．

另外，胡知淵等［22］應(yīng)用Giemsa染色法對(duì)浙江金華地區(qū)棘胸蛙、虎紋蛙和黑斑蛙的血細(xì)胞進(jìn)行了顯微觀察和各形態(tài)參數(shù)測(cè)定，結(jié)果表明紅細(xì)胞和白細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量比例有一定屬和種的特征．這表明將血細(xì)胞的研究作為種質(zhì)鑒定的指標(biāo)也是具有可行性的．

2．3 生化遺傳學(xué)研究

生化遺傳標(biāo)記即基因產(chǎn)物標(biāo)記，如血清蛋白、同工酶、等位酶等的標(biāo)記．同工酶標(biāo)記是一類新型的遺傳標(biāo)記方法，實(shí)驗(yàn)方法規(guī)范、簡便和快速，是一種較好的種質(zhì)資源檢測(cè)方法．用于無尾兩棲類種質(zhì)鑒定的生化遺傳標(biāo)記多為同工酶標(biāo)記［23-25］．

劉楚吾等［19］對(duì)湖南漢壽地區(qū)的牛蛙、黑斑蛙和虎紋蛙3種蛙的晶體、腦、心臟和肌肉4種組織的乳酸脫氫酶同工酶進(jìn)行了研究，表明3種蛙存在著乳酸脫氫酶同工酶的組織特異性和種的特異性．范燕等［26］對(duì)虎紋蛙胚胎發(fā)育各階段的酯酶(EST)、蘋果酸脫氫酶(MDH)和乳酸脫氫酶(LDH)進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其不同生長階段的酶譜不完全相同．陳才法等［27］采用聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，研究并比較了采自安徽省六安市的虎紋蛙和江蘇省徐州市的金線蛙的腦、肝、心臟、骨骼肌4種組織的LDH同工酶，結(jié)果顯示LDH同工酶具有一定的組織特異性，并且在肝臟、心臟和骨骼肌中表現(xiàn)出一定的種間差異．

2．4 分子遺傳學(xué)研究

近些年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)已有數(shù)十種，用于種質(zhì)鑒定的DNA標(biāo)記方法的發(fā)展也極其迅速，主要有限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)記、微衛(wèi)星 DNA(SSR)標(biāo)記、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(RAPD)、AFLP(amplified fragment length polymorphism)技術(shù)和線粒體DNA(mtDNA)標(biāo)記等．有關(guān)無尾兩棲類的分子標(biāo)記方法主要集中于mtDNA［28-29］，ISSR(inter-simple sequence repeat)［30］，RAPD［31］和SSR［32］等．

劉麗等［33-34］應(yīng)用RAPD技術(shù)研究了中國虎紋蛙和泰國虎紋蛙的種內(nèi)種間遺傳多樣性及種質(zhì)特異性標(biāo)記，指出:2種虎紋蛙的遺傳多樣性都比較豐富，但野生的中國虎紋蛙種群的遺傳多樣性還不如經(jīng)多代馴化和養(yǎng)殖的泰國虎紋蛙種群的豐富;并在基于RAPD的基礎(chǔ)上運(yùn)用序列特異性擴(kuò)增技術(shù)(SCAR)設(shè)計(jì)出鑒定2種虎紋蛙的分子標(biāo)記，為中國虎紋蛙和泰國虎紋蛙的發(fā)展趨勢(shì)的監(jiān)測(cè)及品種的鑒定提供了理論依據(jù)．

黃建偉等［35］通過比較虎紋蛙、黑斑蛙、金線蛙、澤蛙、凹耳蛙和福建大頭蛙6種蛙的16 S rRNA的序列和二級(jí)空間結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)空間結(jié)構(gòu)分析與序列比較結(jié)果存在一定的差異，虎紋蛙、黑斑蛙和澤蛙的二級(jí)結(jié)構(gòu)相似，但與黑斑蛙同屬的金線蛙存在較大差異，凹耳蛙和福建大頭蛙與其他蛙類的二級(jí)結(jié)構(gòu)差別較大，證實(shí)了二級(jí)結(jié)構(gòu)也能作為系統(tǒng)發(fā)育的資料以確定進(jìn)化關(guān)系．

3 虎紋蛙人工養(yǎng)殖及存在問題

為了滿足市場(chǎng)需求及保護(hù)自然資源，羅琛等［36］首次開展了虎紋蛙人工養(yǎng)殖的初步研究．隨后，許多學(xué)者對(duì)虎紋蛙人工養(yǎng)殖的相關(guān)技術(shù)進(jìn)行了研究和探討，基本上解決了人工養(yǎng)殖［37-38］、人工繁殖與育苗［39-40］等一系列關(guān)鍵技術(shù)．

近幾年我國虎紋蛙養(yǎng)殖業(yè)在南方部分地區(qū)得到了較快發(fā)展，尤其是生態(tài)種養(yǎng)實(shí)驗(yàn)取得了良好的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會(huì)效益．例如:黃志平［41-42］先后開展的水稻、虎紋蛙生態(tài)種養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和虎紋蛙、魚、林生態(tài)種養(yǎng)實(shí)驗(yàn);鐘傳明［43］對(duì)雜交虎紋蛙水稻種養(yǎng)技術(shù)的研究;吳建平［44］“水稻-虎紋蛙”生態(tài)農(nóng)業(yè)模式的研究等，都取得了顯著的成果．

雖然虎紋蛙的人工養(yǎng)殖取得了一定的成功，減輕了對(duì)野外種群的壓力，但是還存在一些問題:

1)人工養(yǎng)殖至今沒有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，缺乏人工選育的優(yōu)良品種，繁殖群體的選擇存在一定的盲目性．不少地方養(yǎng)殖場(chǎng)初始繁殖種群大都是收購或捕捉的野生種群．

2)品種交流存在一定的隨意性，人為虎紋蛙雜交現(xiàn)象嚴(yán)重．因目前未建立虎紋蛙苗種注冊(cè)制度，各地虎紋蛙的種苗都是流通的，導(dǎo)致各地品種交流頻繁，最終導(dǎo)致遺傳多樣性下降和種質(zhì)退化．

3)引種憂患．1995年首次引進(jìn)了外形酷似中國虎紋蛙的泰國虎紋蛙［45］，新品種的引進(jìn)暫時(shí)緩解了市場(chǎng)供需矛盾，但是泰國虎紋蛙的早期胚胎發(fā)育所需時(shí)間比中國虎紋蛙少22．1 h［46］，也就是胚胎發(fā)育階段泰國虎紋蛙比中國虎紋蛙生長快．并且，與中國虎紋蛙相比，泰國虎紋蛙的遺傳多樣性豐富、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)．由于泰國虎紋蛙與中國虎紋蛙競爭相同的生態(tài)位，所以繁殖能力和適應(yīng)能力強(qiáng)的泰國虎紋蛙很有可能完全侵占中國虎紋蛙的生態(tài)位，從而使中國虎紋蛙處于更加瀕危的境地［33］．有調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在市場(chǎng)價(jià)格比較低或養(yǎng)殖池中出現(xiàn)病蛙時(shí)，蛙農(nóng)就放棄養(yǎng)殖，將泰國虎紋蛙成池地隨意放到周邊自然環(huán)境中［47］，可能導(dǎo)致中國野生虎紋蛙個(gè)體基因組成的改變，使得原種種質(zhì)資源遭到污染，生存受到威脅．

4 虎紋蛙種質(zhì)資源保護(hù)建議

目前，對(duì)于虎紋蛙種質(zhì)資源的保護(hù)和研究已刻不容緩．根據(jù)以上所述內(nèi)容，我們建議對(duì)虎紋蛙種質(zhì)資源的保護(hù)應(yīng)做好以下方面的工作:

1)從虎紋蛙的資源現(xiàn)狀來看，必須大力保護(hù)野生虎紋蛙的棲息地，明確現(xiàn)有資源現(xiàn)狀并進(jìn)行科學(xué)評(píng)價(jià);對(duì)非法捕殺、販賣野生個(gè)體的行為進(jìn)行嚴(yán)厲打擊;通過媒體加大保護(hù)野生個(gè)體的宣傳力度;加強(qiáng)和健全保護(hù)區(qū)的管理制度．另外，對(duì)于一些具有代表性的種群或數(shù)量很少的種群，可以進(jìn)行遷地保護(hù)．

2)從種質(zhì)資源研究現(xiàn)狀來看，有關(guān)虎紋蛙從種質(zhì)角度進(jìn)行的研究還較少．保護(hù)虎紋蛙種質(zhì)資源就是保護(hù)虎紋蛙的遺傳多樣性．我們建議從形態(tài)水平、細(xì)胞水平、生化水平和分子水平等層面對(duì)本地種群的種質(zhì)進(jìn)行全面系統(tǒng)的研究，建立虎紋蛙種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn);通過對(duì)各地理種群的研究，建立和完善虎紋蛙種質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫．旨在為種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、保護(hù)和合理利用及后續(xù)的良種選育提供基礎(chǔ)資料．

3)從人工養(yǎng)殖現(xiàn)狀及存在的問題來看，為避免虎紋蛙種質(zhì)受污染，保持種質(zhì)的純潔性，必須加強(qiáng)中國虎紋蛙的原種鑒定、保存及優(yōu)良品種的選育;建立原、良種場(chǎng)，避免不必要的近交和近交衰退;規(guī)范苗種生產(chǎn)、銷售行為，向社會(huì)提供優(yōu)質(zhì)的種苗;養(yǎng)殖場(chǎng)引種時(shí)要清楚種苗的遺傳背景，不能為了追求經(jīng)濟(jì)利益而盲目引種．

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