李平 溫海

(第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚科，上海200003)

1 前 言

隱球菌系環(huán)境腐生菌，常引起免疫功能低下人群的感染，同時(shí)格特隱球菌還可以引起較少數(shù)的免疫功能正常的人群的暴發(fā)感染。中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染(腦脊膜炎腦膜腦炎)是隱球菌病的最主要的臨床表現(xiàn)，肺部、皮膚、眼部以及泌尿生殖系感染的發(fā)病率也愈來(lái)愈高。隱球菌性腦膜炎/腦膜腦炎(Cryptococcal meningitis/meningoencephalitis，CME)是其高病死率的最主要的原因。隱球菌病主要是通過(guò)呼吸道吸入其病原體而發(fā)病，在免疫功能正常人群中常表現(xiàn)為無(wú)癥狀攜帶者，顯性感染主要發(fā)生于免疫力低下的患者尤其是T細(xì)胞功能缺陷患者。很多疾病與隱球菌病有關(guān)，主要包括艾滋病、組織器官移植、血液腫瘤、肉瘤樣病、特發(fā)性CD4+T淋巴細(xì)胞減少癥以及高IgM綜合征等［1］。

雖然抗真菌藥物的研究取得了很大的進(jìn)展，隱球菌病尤其是CME以及播散性隱球菌病的病死率仍然很高，在非洲尤為明顯。目前雖然有高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療 (HAART)的出現(xiàn)，但艾滋病患者隱球菌病的急性期病死率并未下降，器官移植患者隱球菌病的病死率在15% ～20%之間，而一旦發(fā)生CME，其病死率高達(dá)40%［2］，應(yīng)引起臨床醫(yī)生的足夠重視。

2 輔助檢查

隱球菌病的輔助檢查主要包括影像學(xué)檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查，后者是確診隱球菌病的主要依據(jù)。

2.1 影像學(xué)檢查

影像學(xué)檢查主要用于診斷肺隱球菌病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)隱球菌病，肺隱球菌病的影像學(xué)表現(xiàn)多樣，與患者免疫狀態(tài)有關(guān)，免疫功能正?；颊咭苑尾拷Y(jié)節(jié)多見(jiàn)，易誤診為肺癌［3］，亦可表現(xiàn)為斑片狀影，而免疫功能缺陷患者多表現(xiàn)為滲出影。中樞神經(jīng)系統(tǒng)隱球菌病頭部影像學(xué)檢查多無(wú)明顯改變，少數(shù)情況下可以發(fā)現(xiàn)隱球菌肉芽腫及軟化病灶。對(duì)于影像學(xué)檢查高度懷疑隱球菌感染時(shí)，應(yīng)及時(shí)行相關(guān)特異性檢查如血清學(xué)檢測(cè)，以防漏診誤診。

2.2 真菌直接鏡檢

腦脊液墨汁涂片是目前最常用的檢查，該方法可以快速、早期診斷隱球菌病。對(duì)腦脊液樣本進(jìn)行離心可以增加鏡檢的靈敏度，但是淋巴細(xì)胞溶解所產(chǎn)生的偽粒子可以造成結(jié)果的假陽(yáng)性［4］，髓小球、脂肪小滴、組織細(xì)胞同樣可以造成假陽(yáng)性結(jié)果，且涂片結(jié)果并不能反映臨床療效，因此具有一定的局限性。

2.3 組織病理學(xué)

肺、皮膚、骨髓、腦以及其他部位組織的病理學(xué)染色檢查可以檢測(cè)到帶莢膜的隱球菌，且離心的腦脊液樣本的病理學(xué)檢查比墨汁涂片具有更高的靈敏度［5］。其他體液以及針穿樣本如從淋巴結(jié)、腎上腺等同樣可以做細(xì)胞學(xué)檢查。實(shí)時(shí)超聲引導(dǎo)下的經(jīng)皮胸腔穿刺肺部結(jié)節(jié)、腫物、浸潤(rùn)性損害部位可以安全、正確地診斷肺隱球菌病。常見(jiàn)非特異的染色方法包括吉姆薩和吖啶橙染色等。特異性染色包括幾丁質(zhì)的卡爾科弗盧爾熒光染色劑(Calcofluor)染色，細(xì)胞壁的GMS染色等等。吖啶橙染色以及隨后的熒光顯微鏡檢查其敏感度與印度墨汁染色檢查、乳膠凝集反應(yīng)類似。作為隱球菌細(xì)胞壁的獨(dú)特成分，多糖莢膜可以通過(guò)特異的染色方法觀察，包括粘蛋白卡紅、阿申藍(lán)染色等等［4］。

2.4 血清學(xué)檢測(cè)

檢測(cè)血清或體液中的莢膜多糖抗原是目前最常用的血清學(xué)方法，目前市售乳膠凝集反應(yīng)試劑盒可以檢測(cè)出10 ng/mL的莢膜多糖抗原，該類試劑盒的敏感性和特異性因標(biāo)本的種類不同而稍有差異。類風(fēng)濕因子是造成假陽(yáng)性最主要的原因，而前帶效應(yīng)被認(rèn)為是腦脊液膠乳凝集反應(yīng)假陰性的最主要原因［4］。目前也有檢測(cè)多糖抗原GXM的酶聯(lián)免疫試劑盒［6］，其結(jié)果不受類風(fēng)濕因子的影響，敏感性和特異性與乳膠凝集試劑盒相當(dāng)。

2.5 真菌培養(yǎng)和鑒定

真菌培養(yǎng)和鑒定是診斷隱球菌病的金標(biāo)準(zhǔn)，通常，通過(guò)48～72 h的培養(yǎng)，陽(yáng)性標(biāo)本即可見(jiàn)菌落形成，但系統(tǒng)性抗真菌治療的患者需要更長(zhǎng)時(shí)間才可見(jiàn)菌落形成。真菌培養(yǎng)往往會(huì)因?yàn)榫窟^(guò)低或活力不佳而容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行離心后培養(yǎng)可以提高陽(yáng)性率。另外，支氣管分泌物、尿液標(biāo)本等通常存在其他微生物的污染，雜菌的快速生長(zhǎng)會(huì)抑制隱球菌的生長(zhǎng)而干擾結(jié)果的判斷［4］。

2.6 分子生物學(xué)方法

分子生物學(xué)方法并不是隱球菌病的常規(guī)診斷方法，但因其具有高靈敏的和高度特異性，可以克服傳統(tǒng)診斷的各種缺陷，因此在菌種鑒定、分型、分子流行病學(xué)方面應(yīng)用廣泛。這些方法包括基因測(cè)序、PCR以及其他基于PCR的方法，如巢式PCR技術(shù)、多重PCR技術(shù)，在非傳統(tǒng)隱球菌所致隱球菌病的診斷中具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。此外，PCR指紋圖、PCR-RFLP、AFLP以及多位點(diǎn)序列分析(MLST)在隱球菌病的致病菌基礎(chǔ)研究和流行病學(xué)研究中應(yīng)用廣泛［7］。

3 藥物治療

氟胞嘧啶(5-FC)是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)具有抗隱球菌活性的藥物，但隱球菌易對(duì)其產(chǎn)生耐藥性。多烯類抗真菌藥物兩性霉素B(AmB)對(duì)大多數(shù)真菌有效，且較少出現(xiàn)耐藥，但具有嚴(yán)重的不良反應(yīng)，主要是急性腎功能衰竭。AmB脂質(zhì)體制劑的腎毒性作用明顯減輕。另一個(gè)不良反應(yīng)就是低鉀血癥和低鎂血癥。三唑類抗真菌藥同樣具有明顯的抗隱球菌活性，最常用為氟康唑，亦可以選用伊曲康唑治療，新的藥物如伏立康唑和泊沙康唑在體外也具有明顯的抗隱球菌活性，在某些臨床研究中將其作為補(bǔ)救治療可取得明顯療效［8，9］。

3.1 中樞神經(jīng)系統(tǒng)隱球菌病

中樞神經(jīng)系統(tǒng)隱球菌病最常見(jiàn)為腦膜炎腦膜腦炎(CME)。與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)的因素包括:腦脊液印度墨汁涂片陽(yáng)性、腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)＜20/μL、腦脊液或血清隱球菌抗原滴度＞1∶1 024、出現(xiàn)神經(jīng)外感染或高腦脊液壓、異常腦部成像以及精神狀態(tài)的改變等等［1］。目前推薦分階段治療CME，首先使用AmB+5-FC誘導(dǎo)治療，隨后使用氟康唑鞏固治療和維持治療［10］。美國(guó)感染病學(xué)會(huì)(IDSA)2000年推薦治療隱球菌腦膜炎的方案為AmB(0.7 ～ 1 mg·kg-1·d-1)+5-FC(100 mg·kg-1·d-1)，通常誘導(dǎo)2周，但應(yīng)個(gè)體化。如有下列情形，誘導(dǎo)期應(yīng)延長(zhǎng):臨床癥狀無(wú)改善者、2周后腦脊液培養(yǎng)仍陽(yáng)性者、腦脊液持續(xù)高抗原滴度者、不能給予5-FC的患者［1］。對(duì)于腎功能損害的患者，可以使用AmB的脂質(zhì)體制劑 (脂質(zhì)體兩性霉素3～6 mg·kg-1·d-1或兩性霉素脂質(zhì)體復(fù)合物5 mg·kg-1·d-1)。誘導(dǎo)治療成功后，采用氟康唑 (400 mg/d)鞏固治療至少10周，氟康唑可根據(jù)病情持續(xù)6～12個(gè)月的治療。對(duì)于HIV患者，10周治療后可將氟康唑減量至200 mg/d，終身維持治療。但近年來(lái)研究顯示，通過(guò)HAART患者免疫功能恢復(fù)后，可根據(jù)患者具體情況停止氟康唑維持治療［11］。不能耐受氟康唑的患者可使用伊曲康唑(400 mg/d)代替［10］。2010年 IDSA 推薦的新標(biāo)準(zhǔn)稍有變化，對(duì)于HIV陰性患者誘導(dǎo)治療時(shí)間改為4周，氟康唑鞏固治療改為至少8周，且根據(jù)病情變化可適當(dāng)調(diào)整。對(duì)于HIV患者，鞏固治療改為至少8周［12］。國(guó)內(nèi)專家推薦的治療方案為兩性霉素B(0.5 ～1 mg·kg-1·d-1)聯(lián)合氟胞嘧啶 (100 mg·kg-1·d-1)誘導(dǎo)治療，至少8周，而后采用氟康唑(200～400 mg/d)鞏固治療至少12周［11］。

研究表明，氟康唑作為初始治療藥物治療時(shí)其療效遜于AmB，在小規(guī)模HIV的CME患者中，與AmB+5-FC相比，單獨(dú)使用氟康唑治療具有更高的治療失敗率，其腦脊液培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰的時(shí)間更長(zhǎng)［13］。氟康唑單獨(dú)治療的低效可能與真菌的耐藥有關(guān)，且氟康唑治療的合適劑量還有待臨床研究確定，有文獻(xiàn)報(bào)道氟康唑劑量的增加并不能增加其療效，但是也有報(bào)道稱高劑量的氟康唑(1 200 mg/d)治療可以降低CME患者的病死率［14］，矛盾的結(jié)論仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

CME患者常有中樞神經(jīng)系統(tǒng)顱內(nèi)壓(ICP)的增高，其機(jī)制不甚清楚，可能與腦脊液的吸收障礙有關(guān)，對(duì)于懷疑CME的所有患者均應(yīng)檢測(cè)顱內(nèi)壓，目前降低顱內(nèi)壓的辦法有反復(fù)腰穿引流或腰椎置管引流或腦脊液腦室腹腔分流術(shù)，而乙酰唑胺治療高顱內(nèi)壓的療效欠佳［15］。

3.2 肺隱球菌病

隱球菌主要經(jīng)肺進(jìn)入機(jī)體而發(fā)病，免疫功能低下的宿主具有發(fā)生肺隱球菌病的高危因素，但肺隱球菌病同樣可以發(fā)生于免疫功能正常宿主。局限性肺疾病的患者血清中通常難以檢測(cè)到隱球菌抗原［16］，如果血清中抗原滴度上升則提示該患者有肺外播散的可能。對(duì)于肺隱球菌病的治療目前尚缺乏前瞻性的研究，治療方案來(lái)源于無(wú)對(duì)照的病例報(bào)告以及小樣本患者的研究。只有輕至中度肺部癥狀的無(wú)肺外播散的免疫功能正?；颊咄ǔ＝o予氟康唑 (400 mg/d)治療，療程6～12個(gè)月，如果患者不能耐受氟康唑，可選用伊曲康唑 (200～400 mg/d)治療，療程6～12個(gè)月。新的藥物如泊沙康唑與伏立康唑也可應(yīng)用，但尚需臨床研究進(jìn)一步證實(shí)其療效。另一方案為AmB(0.5～1 mg·kg-1·d-1)治療，總量為1 000 ～2 000 mg［10］，對(duì)于嚴(yán)重肺疾病的患者可采用與中樞神經(jīng)系統(tǒng)同樣的治療方案加以治療。

對(duì)于免疫功能低下的肺隱球菌病患者，通常會(huì)發(fā)生肺外播散，因此在該類患者中均推薦做腰椎穿刺檢查以及血清抗原監(jiān)測(cè)，如果患者已確診CME、肺外播散或患有嚴(yán)重肺隱球菌病，其治療方案同免疫抑制的中樞神經(jīng)系統(tǒng)隱球菌病患者。在免疫抑制患者中，維持治療是必須的［10］。在艾滋病患者中，如果患者已接受HAART或其免疫功能改善(CD4＞100/μL)可以中斷維持治療，如果患者不能耐受氟康唑，可以選用伊曲康唑(200～400 mg/d)終身治療。對(duì)于表現(xiàn)為孤立的肺結(jié)節(jié)患者可考慮外科手術(shù)治療，也可達(dá)到治愈的目的［17］。因剖腹探查或誤診為腫瘤或其他疾病而行手術(shù)切除者，術(shù)后應(yīng)常規(guī)應(yīng)用抗真菌藥治療，療程至少2個(gè)月［11］。

3.3 非中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肺隱球菌病

除中樞神經(jīng)系統(tǒng)與呼吸道外，隱球菌病可以發(fā)生于機(jī)體的任何器官。其中以皮膚感染最為常見(jiàn)。對(duì)于多數(shù)患者而言，皮膚隱球菌病繼發(fā)于血源播散，但也有少數(shù)報(bào)道為原發(fā)性隱球菌感染。隱球菌還可以感染前列腺，但是該類患者抗真菌治療效果不佳。該類患者臨床報(bào)道不多，多為病例報(bào)告，通常為播散性感染，可參照中樞神經(jīng)系統(tǒng)隱球菌病方案進(jìn)行治療。原發(fā)性皮膚隱球菌感染的治療可以采用氟康唑，200～400 mg/d，治療1～3個(gè)月，亦可采用外科手術(shù)治療［18］。

4 展 望

隱球菌病具有較高的發(fā)病率和病死率，已經(jīng)引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注，其發(fā)病機(jī)制和治療策略是研究的重點(diǎn)。通過(guò)佐劑免疫治療，提高機(jī)體的細(xì)胞與體液抗真菌免疫反應(yīng)從而改善機(jī)體對(duì)抗真菌治療的反應(yīng)，是目前研究的熱點(diǎn)。使用隱球菌莢膜的單克隆抗體治療隱球菌病已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，隱球菌莢膜多糖抗體可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)新生隱球菌的吞噬和殺傷作用［19］，鼠來(lái)源的莢膜特異性單克隆抗體治療20例隱球菌病的一期臨床研究在國(guó)外已經(jīng)完成［20］，高劑量的單克隆抗體可以暫時(shí)降低血清中多糖抗原的水平，但肌痛、背痛以及短暫的蕁麻疹反應(yīng)是主要的副作用，其臨床療效仍需進(jìn)一步研究。Th1型細(xì)胞因子IFN-γ也被用于CME的治療，IFN-γ可與AmB協(xié)同作用抑制細(xì)胞內(nèi)新生隱球菌的生長(zhǎng)，CME幸存者腦脊液中的IL-6、IFN-γ、TNF-α 和 IL-8 要明顯高于死亡者［21］。IFN-γ還可以降低腦脊液中的隱球菌負(fù)荷，目前仍需通過(guò)大規(guī)模臨床實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其療效。鑒于免疫治療目前尚處在萌芽階段，開發(fā)新的高效殺真菌活性藥物及低毒性藥物仍是我們急需解決的問(wèn)題。

［1］ Ritter M ，Goldman DL.Pharmacotherapy of cryptococcosis［J］.Expert Opin Pharmacother，2009，10(15):2433-2443.

［2］ Lortholary O，Poizat G，Zeller V，et al.Long-term outcome of AIDS-associated cryptococcosis in the era of combination antiretroviral therapy［J］.AIDS，2006，20(17):2183-2191.

［3］ Lindell RM，Hartman TE，Nadrous HF，et al.Pulmonary cryptococcosis:CT findings in immunocompetent 19 patients［J］.Radiology，2005，236(1):326-331.

［4］ Chayakulkeeree M ，Perfect JR.Cryptococcosis［J］.Infect Dis Clin N Am，2006，20(3):507-544.

［5］ Sato Y，Osabe S，Kuno H，et al.Rapid diagnosis of cryptococcal meningitis by microscopic examination of centrifuged cerebrospinal fluid sediment［J］.J Neurol Sci，1999，164(1):72-75.

［6］ Feldmesser M，Harris C，Reichberg S，et al.Serum cryptococcal antigen in patients with AIDS ［J］.Clin Infect Dis，1996，23(4):827-830.

［7］ Sidrim JJ，Costa AK ，Cordeiro RA ，et al.Molecular methods for the diagnosis and characterization of Cryptococcus:a review［J］.Can JMicrobiol，2010，56(6):445-458.

［8］ Alexander BD，Perfect JR，Daly JS，et al.Posaconazole as salvage therapy in patients with invasive fungal infections after solid organ transplant［J］.Transplantation，2008，86(6):791-796.

［9］ Bandettini R，Castagnola E，Calvillo M，et al.Voriconazole for cryptococcal meningitis in children with leukemia or receiving allogeneic hemopoietic stem cell transplant［J］.J Chemother，2009，21(1):108-109.

［10］ Saag MS，Graybill RJ，Larsen RA，et al.Practice guidelines for the management of cryptococcal disease［J］.Clin Infect Dis，2000，30(4):710-718.

［11］ 《中國(guó)真菌學(xué)雜志》編輯委員會(huì).隱球菌感染診治專家共識(shí)［J］.中國(guó)真菌學(xué)雜志，2010，5(2):65-68.

［12］ Perfect JR，Dismukes WE，Dromer F，et al.Clinical practice guidelines for the management of cryptococcal disease:2010 update by the infectious diseases society of America［J］.Clin In fect Dis，2010，50(3):291-322.

［13］ Larsen RA，Leal MA，Chan LS.Fluconazole compared with amphotericin B plus flucytosine for cryptococcal meningitis in AIDS.A randomized trial［J］.Ann Intern Med，1990，113(3):183-187.

［14］ Longley N，Muzoora C，Taseera K，et al.Dose response effect of high-dose fluconazole for HIV-associated cryptococcal meningitis in southwestern Uganda［J］.Clin Infect Dis，2008，47(12):1556-1561.

［15］ Newton PN，Thai LH，Tip NQ，et al.A randomized，doubleblind，placebo-controlled trial of acetazolamide for the treatment of elevated intracranial pressure in cryptococcal meningitis［J］.Clin Infect Dis，2002，35(6):769-772.

［16］ Baddley JW，Perfect JR，Oster RA，et al.Pulmonary cryptococcosis in patients without HIV infection:factors associated with disseminated disease［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2008，27(10):937-943.

［17］ 劉明，姜格寧.肺隱球菌病的外科治療［J］.中華結(jié)核呼吸雜志，2006，29(5):307-309.

［18］ Revenga F，Paricio JF，Merino FJ.Primary cutaneous eryptococcosis in an immunocompetent host:case report and review of the literature［J］.Dermatology，2002，204(2):145-149.

［19］ Dromer F，Charreire J.Improved amphotericin B activity by a monoclonal anti-Cryptococcus neoformans antibody:study during murine cryptococcosis and mechanisms of action［J］.J Infect Dis，1991，163(5):1114-1120.

［20］ Larsen RA，Pappas PG，Perfect J，et al.Phase I evaluation of the safety and pharmacokinetics of murine-derived anticryptococcal antibody 18B7 in subjects with treated cryptococcal meningitis［J］.Antimicrob Agents Chemother，2005，49(3):952-958.

［21］ Siddiqui AA，Brouwer AE，Wuthiekanun V，et al.IFN-gamma at the site of infection determines rate of clearance of infection in cryptococcal meningitis［J］.J Immunol，2005，174(3):1746-1750.