商立民,金洪濤,劉 全

藍氏賈第鞭毛蟲病(giardiasis),簡稱賈第蟲病,是由藍氏賈第鞭毛蟲(Giardia lamblia)引起的一種以腹瀉為主要癥狀的腸道疾病,也有人稱藍氏鞭毛蟲病(lambliasis)。因賈第蟲病曾在國際旅游者中流行,故又稱為“旅游者腹瀉”。

自20世紀70年代以來,在世界各地相繼發(fā)生了本病的流行或暴發(fā)流行,相關(guān)的研究也確認賈第鞭毛蟲是導致人類腹瀉的最主要寄生性原蟲,估計每年導致約2.8億人感染[1]。近年來,在艾滋病患者中常發(fā)現(xiàn)有賈第蟲的合并感染,在同性戀人群中本病亦可互相傳播,賈第蟲已被認為是一種機會致病性原蟲,其重要性已引起各國重視。由于賈第蟲可感染人和多種野生動物及家養(yǎng)動物,故目前國際上已將賈第蟲病列入人獸共患寄生蟲病。

賈第蟲病呈全球性分布,據(jù)WHO估計,全世界人群感染率約為1%～20%,其臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣,從急慢性腹瀉、腹痛、惡心、嘔吐、胃腸脹氣到無明顯臨床癥狀[2],極易與其他疾病相混淆,從而忽視或延誤了本病的治療,因此快速、準確診斷對本病的治療和監(jiān)控起著十分重要的作用,本文就賈第蟲病的分子生物學診斷方法及其應(yīng)用加以綜述。

1 多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)

對賈第蟲進行鑒定和基因分型的靶基因主要有:小亞單位rRNA基因(SSU-rRNA)、β賈第素基因(β-giardin)、谷氨酸脫氫酶基因(gdh)、α-延伸因子1基因(ef-1)、磷酸丙糖異構(gòu)酶基因(tpi)等[3]。Rebecca等應(yīng)用PCR方法檢測賈第蟲小亞單位rDNA基因和傳統(tǒng)的檢測方法對曼谷204份人糞便和229份犬糞便進行檢測比較,結(jié)果顯示PCR方法具有較高的特異性和敏感性[4]。通過對上述賈第蟲特定基因的擴增和序列分析,比較其基因片段的特異性,對賈第蟲進行分型,將其分為了7個有效聚集體,即聚集體(A-G)。Erica等對從灰海豹糞便中提取賈第蟲基因組,用谷氨酸脫氫酶基因(gdh)進行分型鑒定,在原有的七種聚集體之外發(fā)現(xiàn)了第八種聚集體,即集聚體H,這種新聚集體的發(fā)現(xiàn)說明賈第蟲具有更為豐富的遺傳多樣性和更為廣泛的宿主范圍[5]。

2 實時熒光定量PCR(Real-time PCR)

Real-time PCR方法能夠?qū)μ禺惡怂釘U增的全過程進行連續(xù)的實時監(jiān)測,能夠測定樣品起始模板的核酸含量,從而對樣品中含有的蟲體數(shù)量進行定量檢測。此外,相對于傳統(tǒng)的PCR方法Real-time PCR具有更高的敏感性,而且能夠在閉合管內(nèi)進行高通量分析,無需對擴增產(chǎn)物進行電泳分析,避免了樣品污染的可能[6]。

Adriana等用Real-time PCR法與傳統(tǒng)的鏡檢和抗原檢測方法對意大利疑似腸道寄生蟲感染的771份患者糞便樣品進行檢測,與傳統(tǒng)方法相比較Real-time PCR具有100%的特異性和敏感性[7]。Verweij等用Real-time PCR方法對賈第蟲小亞單位rRNA基因進行擴增檢測,對104份已知含有賈第蟲包囊的糞便標本檢測,102份陽性,特異性達到98.1%;對賈第蟲抗原陽性的糞便標本進行檢測亦呈陽性[8]。Binz等應(yīng)用探針法熒光定量PCR技術(shù)能夠檢測出0.8個賈第蟲滋養(yǎng)體,具有較高的特異性和敏感性[9]。

3 反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)

盡管常規(guī)PCR方法對樣本中存在的賈第蟲檢測具有高度的特異性和敏感性,但不能區(qū)分包囊是否具有活性和感染力,因此在對環(huán)境樣品檢測時,需要建立一種特異的方法來檢測環(huán)境中樣本是否含有有活性的包囊,由于 RT-PCR依賴于mRNA的完整性,而 mRNA的半衰期通常較短,因此完整的mRNA即可證實活性包囊的存在。應(yīng)用RT-PCR方法檢測賈第蟲mRNA即可檢出樣品中是否含有活性包囊。由于包囊在熱應(yīng)激條件下可大量合成熱休克蛋白(hsp)70,因此RT-PCR通常將熱休克蛋白(hsp)70作為目的基因進行檢測,能夠增加檢測活性包囊的敏感性[10]。

Gyu-Cheol等針對賈第蟲的熱休克蛋白(hsp)70基因設(shè)計特異的引物對水生系統(tǒng)中有活性的包囊進行檢測,檢測的敏感性可達到1個包囊/100μL,在熱應(yīng)激的條件下檢測的敏感性可以增加1000倍,這種檢測的高敏感性在檢測環(huán)境樣品中是否含有活性的包囊具有重要意義[11]。

4 多重PCR(multiplex PCR)

多重PCR是通過在同一PCR反應(yīng)體系里加上二對以上引物,同時擴增出多個核酸片段的PCR反應(yīng),可以對多種致病因子進行鑒定和檢測,具有高效性、經(jīng)濟性和簡便性等特點[12]。

Stark D等應(yīng)用多重PCR技術(shù)與real-time PCR(RT-PCR)相比較用來檢測包括賈第蟲在內(nèi)的4種常見的致病原蟲,發(fā)現(xiàn)多重PCR與RT-PCR的符合率達到100%,而且多重PCR具有很高的特異性和敏感性,沒有交叉反應(yīng)發(fā)生[13]。Taniuchi M 等應(yīng)用多重PCR技術(shù)對腸道寄生蟲檢測的敏感性和特異性分別為83%和100%,故可用此方法對腸道寄生蟲進行篩選[14]。

5 基因芯片技術(shù)(microarray)

基因芯片技術(shù)(microarray)是指將成千上萬DNA克隆片段或寡核苷酸片段固定在固體表面(玻璃片或尼龍膜)上,用熒光或其他標記的mRNA,cDNA或基因組DNA探針進行雜交,從而同時快速檢測多個基因表達狀況,進行DNA分析等的一種技術(shù),其基本原理是基于Southern雜交或斑點雜交技術(shù)?；蛐酒夹g(shù)應(yīng)用于基因表達水平檢測的最大優(yōu)越性是可自動、快速檢測目的材料中成千上萬個基因的表達情況。

Dae-Young等研制了針對小亞基 rRNA基因檢測包括賈第蟲在內(nèi)的三種原蟲基因芯片技術(shù),其檢測的敏感性可達到50個包囊/次,該技術(shù)能夠避免環(huán)境樣品中存在的PCR抑制劑對PCR檢測的影響,具有很好的特異性,不與非靶基因發(fā)生交叉反應(yīng)也無假陰性反應(yīng)[15]。Wang等研制的寡核苷酸微陣列技術(shù)不僅能夠?qū)Z第蟲進行檢測,而且還能對其進行基因分型,其高度的敏感性和特異性為大量臨床和環(huán)境樣品的檢測和基因分型提供了一種行之有效的方法[16]。

6 熒光原位雜交(FISH)

熒光原位雜交技術(shù)的基本原理是應(yīng)用熒光標記的核酸探針與同源互補的靶DNA經(jīng)變性-退火-復(fù)性,形成靶DNA與核酸探針的雜交體,經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析。

Lemos等用FISH方法與賈第蟲18S rRNA進行雜交對賈第蟲進行檢測[17],Dorsch等針對賈第蟲16S rRNA設(shè)計的熒光標記的寡核苷酸探針,利用rRNA只在有活性的包囊中高效表達的特性,對賈第蟲有活性的包囊進行檢測[18],Graczyk等將熒光原位雜交技術(shù)與針對賈第蟲細胞壁抗原決定簇的FITC標記的單克隆抗體技術(shù)相結(jié)合,能夠?qū)Z第蟲有活性的單個包囊進行檢測[19]。

7 環(huán)介導等溫擴增(LAMP)

環(huán)介導等溫擴增技術(shù)是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異引物,在具有鏈置換活性功能的DNA聚合酶的作用下實現(xiàn)等溫條件下DNA分子的核酸擴增技術(shù),該方法具有特異性高、操作方便等特點[20]。

Nago TT等應(yīng)用LAMP技術(shù)對賈第蟲病患者的糞便樣本進行檢測,結(jié)果顯示檢測敏感性為84%(16/19),能夠檢出的最少蟲體數(shù)可達到3.12×10-1個,相對于傳統(tǒng)的鏡檢方法敏感性提高了400倍以上,從而為臨床樣本的檢測提供了一種高敏感性和準確性的方法[21]。

8 展 望

分子生物學技術(shù)為賈第蟲的快速診斷提供了一個平臺,各種檢測方法的應(yīng)用使我們對賈第蟲的生物學有了更進一步的認識。視檢測目的不同,采用不同的檢測方法,PCR方法可以對賈第蟲進行檢測、基因分型和流行病學調(diào)查,Real-time PCR可對環(huán)境樣品賈第蟲含量進行定量分析,RT-PCR主要是對環(huán)境樣品中含有的包囊進行活性和感染力的檢測,多重PCR可同時檢測多種寄生蟲,基因芯片技術(shù)可同時對多個不同的目的基因進行檢測等。隨著分子生物學的迅速發(fā)展以及其在賈第蟲方面的廣泛應(yīng)用,將有助于對賈第蟲的宿主特異性、傳播途徑和流行趨勢等方面有更好的了解。

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