王卓龍 李夢濤 曾小峰 （中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院北京協(xié)和醫(yī)院風濕免疫科,北京 100032）

Pristane誘導狼瘡鼠模型

王卓龍 李夢濤 曾小峰 （中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院北京協(xié)和醫(yī)院風濕免疫科,北京 100032）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus,SLE）是一種累及全身多系統(tǒng)器官組織的自身免疫性疾病,血清中存在以抗核抗體、抗dsDNA抗體為代表的多種自身抗體,目前病因、發(fā)病機理尚不完全清楚。合適的動物模型有助于對其進行研究。SLE動物模型分為自發(fā)性模型和誘導性模型。自發(fā)性狼瘡小鼠要求小鼠嚴格傳代,側重研究遺傳因素對SLE發(fā)病的影響。誘導性狼瘡小鼠模型是指應用誘導劑使小鼠出現(xiàn)類似人類SLE病變表現(xiàn)的動物模型,主要用于研究環(huán)境因素對SLE發(fā)病的影響。

Pristane化學名是2,6,10,14-四甲基十五烷（2,6,10,14-tetramethylpentadecane,TMPD）。自從SatohM等1995年發(fā)現(xiàn)給非自發(fā)性免疫鼠BALB/c ByJ鼠一次性腹腔注射Pristane 0.5m l可成功誘導小鼠狼瘡以來,該方法已成為誘導狼瘡小鼠模型最常用方法[1,2]。本文就Pristane誘導狼瘡小鼠模型綜述如下。

1 Pristane誘導小鼠狼瘡模型表現(xiàn)

包括免疫復合物型腎炎、關節(jié)炎、血管炎、血清中多種自身抗體等[2-4]。

腎小球腎炎 經Pristane誘導后大多數(shù)BALB/c鼠、SJL/J鼠均出現(xiàn)蛋白尿,嚴重程度不等,1+～4+。在注射Pristane后6個月的腎臟病理檢查見免疫復合物型腎小球腎炎,光鏡下表現(xiàn)為節(jié)段性或彌漫性增殖性腎小球腎炎,可見輕、中度單核細胞侵潤,系膜基質和系膜細胞增生,上皮和內皮細胞增生,毛細血管袢銀耳環(huán)征,電子顯微鏡可發(fā)現(xiàn)上皮下和系膜區(qū)出現(xiàn)免疫復合物沉積。免疫熒光鏡檢查發(fā)現(xiàn)IgM、IgG、C3在系膜區(qū)和系膜毛細血管分布,符合狼瘡腎炎分類標準中的Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型改變[2,3]。Pristane誘導C57BL/10鼠腎損害較輕,為系膜增殖型（Ⅱ型）[4]。

關節(jié)炎 可見于Pristane誘導后大多數(shù)BALB/c鼠,表現(xiàn)為滑膜細胞增生,關節(jié)邊緣侵襲破壞[3,5]。人類SLE的關節(jié)炎為非侵襲破壞性,雖然少部分可出現(xiàn)關節(jié)侵襲破壞,但被認為是重疊綜合征（SLE和類風濕關節(jié)炎重疊）,因此Pristane誘導關節(jié)炎類似類風濕關節(jié)炎。

血管炎 見于全部C57BL/10鼠,為肺臟病理見局灶出血,毛細血管炎伴有血管周圍巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞侵潤,電鏡下見肺泡上皮損傷,但沒有發(fā)現(xiàn)免疫復合物沉積[4]。

異位淋巴組織 腹腔注射Pristane后廣泛腹膜、脾臟、肝臟出現(xiàn)脂肪肉芽腫（Lipogranuloma）,病理檢查見單核吞噬細胞吞噬Pristane油滴,T、B淋巴細胞增殖聚集[3,4,6]。

自身抗體 血中丙種球蛋白增高,為多克隆性,并出現(xiàn)多種自身抗體,包括抗dsDNA抗體、抗 ss-DNA抗體、抗 RNP/Sm抗體、抗Su抗體、抗核糖體P抗體、抗組蛋白抗體。盡管部分小鼠可誘導出抗Ⅱ型膠原抗體和類風濕因子但其滴度低,而與SLE相關的自身抗體（如抗 RNP/Sm、dsDNA、ssDNA、染色質、Su、核糖體P抗原抗體）的滴度高[1-7]。

IgM型抗體出現(xiàn)時間較早,在給小鼠注射Pristane后2周即可出現(xiàn),至3個月6/11出現(xiàn)IgM型抗ss-DNA抗體,4/11出現(xiàn)IgM型抗組蛋白抗體;IgG型抗體出現(xiàn)較晚,在注射Pristane后2～3個月,5/11出現(xiàn)IgG型抗Su抗體,至6個月7/11出現(xiàn)IgG型抗RNP/Sm抗體[2]。而IgG型抗dsDNA抗體常出現(xiàn)更晚。注射Pristane后BALB/c鼠在6個月內沒有發(fā)現(xiàn)抗dsDNA抗體,但至第8個月BALB/c An（IL-6+/+）鼠38%（10/26）出現(xiàn)抗dsDNA抗體強陽性[8]。

細胞因子 外周血IFN-α水平升高,ISGs（Type I interferon-stimulated genes）如 MX-1、IRF7、ISG15 和IP10表達上調[9,10]。

2 造模影響因素

Satoh M使用Pristane誘導BALB/cByJ、BALB.K、SJL/J、A.SW 、B10.S 、C57BL/10、C57BL/6J、B6H2k、B6CH2bm12、DBA/1、DBA/2 小鼠,發(fā)現(xiàn)近交系不同品系小鼠均可誘導產生SLE特異性抗體,但不同品系小鼠誘導出抗體機率和滴度有差異,抗體種類受H2連鎖和非H2基因影響[7]。BALB/cByJ、DBA/1、A.SW、C57Bl/6J均可產生抗Su、抗RNP/Sm 抗體（靶抗原為主要為U1RNP）、抗dsDNA抗體、抗ssDNA抗體、抗組蛋白抗體 ,而A.SW、C57Bl/6J、SJL/J 鼠可產生抗核糖體P抗體（靶抗原為P0,P1,P2）。雌性鼠易誘導出狼瘡樣病變[11]。雖然Pristane誘導小鼠出現(xiàn)狼瘡樣表現(xiàn)不需要特殊喂養(yǎng)環(huán)境[7],但微生物可能為協(xié)同刺激因素,因Pristane誘導狼瘡小鼠產生的IgG型自身抗體水平在屏蔽環(huán)境條件下喂養(yǎng)比在普通環(huán)境條件下喂養(yǎng)要低[3,12]。

3 Pristane誘導小鼠狼瘡與人類 SLE的相關性

人類SLE臨床表現(xiàn)多樣,目前普遍采用美國風濕病學會1997年推薦的SLE分類標準診斷。該分類標準中,符合4項或4項以上者,在除外感染、腫瘤和其它結締組織病后,可診斷為SLE。Pristane可誘導雌性鼠出現(xiàn)病變包括蛋白尿、免疫復合物性腎小球腎炎、關節(jié)炎,自身抗體包括ANA、抗RNP/Sm抗體、抗dsDNA抗體,符合上述SLE診斷標準[3,13]。

自發(fā)性狼瘡小鼠MRL/lpr,Fas基因發(fā)生突變,產生淋巴細胞增生基因（lpr）,淋巴組織異常增生,出現(xiàn)狼瘡樣變化,但是MRL/lpr鼠為IFN-γ及其相關ISGs表達上調,而人類SLE是Ⅰ型干擾素（IFN-I）及其相關ISGs表達上調[14-16]。（NZB×NZW）F1被認為是與人類SLE最為相似的自發(fā)性狼瘡標準模型,該模型胸腺皮質萎縮,T細胞在胸腺中發(fā)育不全。病變包括蛋白尿、免疫復合物性腎小球腎炎;ANA、抗dsDNA抗體,符合美國風濕病學會1997年推薦的SLE分類標準11條中的3條標準[3,13]。但該模型不產生針對包含RNA抗原的自身抗體,盡管給（NZB×NZW）F1注射Pristane后可誘導產生抗RNP抗體[14]。

如果考慮到人類SLE出現(xiàn)IFN-I水平升高,其相關ISGs表達上調,凋亡小體清除障礙[15,16],這些表現(xiàn)在Pristane誘導小鼠狼瘡同樣出現(xiàn),不在其它模型出現(xiàn);如果認定IFN-I異常高表達是SLE致病的重要機制,那么有理由相信Pristane誘導小鼠狼瘡似乎與人類SLE更為相關[13,14]。

4 免疫病理機制

鑒于Pristane誘導小鼠狼瘡與人類SLE良好的相關性,人們把它作為深入了解人類SLE發(fā)病機理的重要模型,對其病理機制進行了大量研究。通常中等長度的烴是可引起炎癥和增強免疫反應的潛在佐劑[17]。BALB/c小鼠腹腔注射佐劑Pristane后,Pristane油滴被單核吞噬細胞吞噬,T、B淋巴細胞增殖聚集形成肉芽腫（異位淋巴組織）。T細胞高度活化,B細胞反應性增高,產生多種自身抗體[18]。有研究認為Pristane可通過線粒體損傷途徑誘發(fā)細胞凋亡,產生的核抗原在細胞因子已發(fā)生明顯改變的腹腔啟動了自身免疫反應[19]。

4.1 自身抗體 存在針對核抗原的自身抗體是人類SLE的主要特征。研究表明Pristane誘導小鼠狼瘡和人類 SLE類似產生自身抗體需要Toll受體（TLR）活化[20-22]。RNA相關抗原可結合TLR7而活化B細胞,活化信號經MyD88傳導[23]。TLR7-/-鼠被Pristane誘導產生的抗 RNA抗體明顯減少,而抗DNA抗體不受影響[21]。TLR4-/-鼠被Pristane誘導產生的抗RNA抗體、抗DNA抗體均明顯減少[22]。

CD1d屬非經典MHCⅠ類分子,CD1d可能在Pristane誘導狼瘡過程中起免疫調節(jié)作用。給CD1d-/-BALB/cJ鼠注射Pristane可比野生型BALB/cJ鼠產生更高滴度IgG型抗dsDNA抗體、抗核糖蛋白P抗體,蛋白尿、腎炎明顯加重[24]。

裸鼠BALB/cnu/nuT細胞存在缺陷,B細胞數(shù)量正常,可自發(fā)產生IgM、IgG型抗ssDNA抗體。注射Pristane后BALB/cnu/nu鼠可產生更高滴度的抗ssDNA抗體,但不產生抗U1RNP、抗Sm抗體;而BALB/cnu/+和BALB/c+/+鼠既可產生抗U1RNP、抗Sm抗體,也可多生抗ssDNA抗體[25]。TSAd-/-（T cell-specific adaptor protein）C57BL/6鼠可自發(fā)產生抗ssDNA抗體、dsDNA抗體,不能被 Pristane誘導產生抗U1RNP、抗Sm抗體[26]。Fas屬于TNF受體家族,可介導凋亡。B6/lpr鼠和B6/gld鼠可自發(fā)產生抗ssDNA/染色質抗體,出現(xiàn)狼瘡樣病變,但因 lpr、gld存在使Pristane不能誘導產生IgG型抗uRNP/Sm/Su/ribosomal P抗體[27]。以上現(xiàn)象表明Pristane誘導自身抗體產生存在復雜的機理。

4.2 腎組織損傷 免疫復合物形成和沉積是引起SLE腎臟損害的主要機制。無論是循環(huán)中的免疫復合物沉積于腎小球或原位形成的免疫復合物兩者均能激活補體,引起炎性細胞浸潤、炎癥介質釋放、凝血因子活化,導致腎小球腎炎?？筪sDNA抗體與腎損害有關[15]。但 Pristane誘導 BALB/c、SJL/J鼠腎損害出現(xiàn)在抗dsDNA抗體產生之前,提示其它抗體可引起腎損傷[2,25]。

Fc受體（FcγR）參與了SLE腎炎發(fā)生。免疫復合物與FcγRⅡB結合可抑制免疫復合物介導的B細胞和樹突狀細胞活化[28],而與FcγR I和FcγR Ⅲ結合可活化炎癥細胞（包括粒細胞、單核巨噬細胞）引起組織損傷。FcγRⅡB-/-鼠經Pristane誘導腎損傷更重[29]。

4.3 細胞因子 Ⅰ型干擾素 SLE患者血中IFN-α水平升高,相關ISGs表達上調,在SLE發(fā)病中的作用越來越受重視[15]。它的產生可由TLR活化引起。TLR3識別雙鏈病毒RNA,TLR4識別類脂、脂多糖,它們通過TRIF信號通路觸發(fā)分泌IFN-Ⅰ;而TLR 7/8識別病毒單鏈RNA、TLR9可識別內源性未甲基化的CpG DNA,通過MyD88信號通路觸發(fā)分泌IFN-Ⅰ[20-23]。對于 Pristane誘導狼瘡鼠 IFN-α產生依賴TLR7/MyD88信號通路[30],由脂肪肉芽腫（異位淋巴組織）中未成熟的Ly6Chi單核細胞產生[31],同樣變化可見于Pristane誘導狼瘡鼠外周血中。IFN-α可調節(jié)TLR7的表達,IFN-I受體（IFNAR2）-/-BALB/c鼠注射Pristane后B細胞TLR7表達下降[14]。

Ⅰ型干擾素在Pristane誘導狼瘡鼠中影響著自身抗體的產生。給IFNAR-/-129Sv鼠和野生型129Sv鼠分別注射Pristane后,發(fā)現(xiàn)在野生型外周血單個核細胞中 IFN-I相關ISGs高表達,出現(xiàn)抗RNP、Sm、ds-DNA抗體,而在 IFNAR-/-則不出現(xiàn)上述抗體。IFNAR2-/-BALB/c鼠注射Pristane后,產生的IgG比野生型鼠下降,但產生的IgM型自身抗體水平升高,B細胞TLR7表達下降,不產生蛋白尿[14]。給IRF9-/-（IFN regulatory factor9）鼠注射Pristane后與野生型鼠比較產生的IgG不高,但產生的IgM型自身抗體水平更高[32]。

IFN-I在免疫復合物腎炎發(fā)病中起重要作用。Pristane誘導的IFNAR-/-129Sv鼠和野生型129Sv鼠一樣腎小球可見免疫復合物沉積,包括IgG、C3沉積,但與野生型不同的是它不出現(xiàn)蛋白尿、腎小球系膜細胞增生等腎小球腎炎表現(xiàn)[10]。

IL-6在人類SLE發(fā)病中起重要作用[33]。腹腔注射Pristane后小鼠腹腔巨噬細胞分泌IL-6增多。IL-6參與了抗DNA抗體的產生過程,IL-6-/-鼠不產生抗DNA抗體,而抗U1RNP、抗Sm抗體的產生不受影響[8]。

5 小結

SLE發(fā)病被認為與遺傳因素、環(huán)境因素有關。Pristane誘導的狼瘡動物模型證明了環(huán)境因素在SLE發(fā)病中的重要性。由于該模型具有SLE特異性抗體、免疫復合物型腎炎,與人類SLE有良好的相關性,目前它已成為人們研究SLE的常用動物模型。

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[收稿2010-10-27 修回2011-01-20]

（編輯 張曉舟）

R392

A

1000-484X（2011）05-0473-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.05.023

王卓龍（1967年-）,男,在讀博士,副主任醫(yī)師,主要從事系統(tǒng)性紅斑狼瘡研究,E-mail:wzhuolong@163.com;

及指導教師:曾小峰（1962年-）,男,教授,博士生導師,主要從事系統(tǒng)性紅斑狼瘡和血管炎研究,E-mail:zengxiaofeng@medmail.com.cn。