楊會棉，蔣秀高

鉤端螺旋體的分子分型方法

楊會棉，蔣秀高

鉤端螺旋體（Leptospira，簡稱鉤體），屬于螺旋體目螺旋體科鉤端螺旋體屬，分為兩個種：雙曲鉤端螺旋體（Leptospira biflexa）和問號鉤端螺旋體（Leptospira interrogans）；前者為腐生性鉤端螺旋體，通常對人和動物不致??；后者為寄生性、致病性鉤端螺旋體，是引起人和動物鉤端螺旋體病的病原體。鉤端螺旋體?。↙eptospirosis，簡稱鉤體?。?，是由問號鉤端螺旋體引起的一種人獸共患疾病，在世界范圍廣泛分布，尤其流行于熱帶及亞熱帶地區(qū)。人感染鉤體病主要因為直接或間接接觸了帶菌動物的尿液、受污染的水或土壤。人患鉤體病的臨床表現(xiàn)輕重不一，從輕微的流感樣癥狀到嚴重的出現(xiàn)黃疸、肺出血、肝腎等多器官衰竭甚至死亡。目前，國際上對鉤端螺旋體的分類方法主要有兩種：血清學分類和基因分類。以血清型為基本分類單位的血清學分類，其分類基礎是存在于菌體外膜上的脂多糖（LPS）的抗原決定基。在全球范圍內(nèi)，鉤體至少包括24個血清群250個血清型［1］。血清學分類的操作主要應用顯微凝集試驗（MAT）和凝集素交叉吸收試驗（CAAT）。該方法需要保存大量的標準菌株，存在操作繁瑣，費時費力等不足之處。血清學分型屬于表型分型，不能反映菌株之間基因上的聯(lián)系［2］?；蚍诸愂峭ㄟ^比較基因DNA片段核苷酸序列同源性對鉤端螺旋體進行鑒定和分類的方法［3］。目前國際上已經(jīng)公布的鉤端螺旋體基因種有20個［4］。基因分類可從遺傳學和分子生物學水平上進一步闡明不同鉤體菌株的差別。隨著近年來分子生物學技術的發(fā)展，一些分子分型方法逐漸被應用到鉤體分子分型上。

1 脈沖場凝膠電泳分型

脈沖場凝膠電泳（Pulsed－field gel electrophoresis，PFGE）其原理將細菌包埋于瓊脂塊中，選用適當?shù)膬?nèi)切酶切割基因組DNA，獲得的DNA片段在外加脈沖電場的瓊脂糖凝膠中進行分離。當電場變換方向時，DNA分子在新的方向泳動前必須重新定向。小的DNA分子比大的分子重新定向快，在凝膠中移動也較快。所以通過不斷地交替改變電場方向，不同大小的DNA片段能夠被分離，在凝膠上按片段長度的不同而呈現(xiàn)出電泳帶型。經(jīng)染色脫色后，在成像儀上呈現(xiàn)酶切后的電泳圖譜，再用Bionumerics軟件分析，就可以判斷菌株之間的圖譜異同。

1992年 Herrmann等［5］應用PFGE對致病性鉤端螺旋體進行分型，結(jié)果顯示88．89%（64／72）鉤體菌株的PFGE圖譜分析結(jié)果與血清學分型結(jié)果一致。18株臨床分離中，有13株鉤體的PFGE圖譜分析結(jié)果符合血清學分型結(jié)果。我國蔣秀高等［6］于2000年采用PFGE法檢測了我國15群15型鉤端螺旋體標準菌株，結(jié)果從50～1 000 kb范圍的DNA片段得到很好的分離效果，各標準菌株均具有特征性圖譜。2008年，Galloway等［7］采用改進的PFGE法檢測206株鉤體，結(jié)果88．83%（183／206）的菌株產(chǎn)生了特征性譜型，同一血清型的不同菌株顯示出高度相似的圖譜。通過這次研究，他們還建立了應用內(nèi)切酶Not I產(chǎn)生的鉤體PFGE圖譜數(shù)據(jù)庫，以便對鉤體菌株進行鑒定和評價。Blanco等［8］對14株臨床分離鉤體菌株進行MAT和PFGE分析，結(jié)果顯示PFGE分型和血清學分型具有一致性。

1996年美國疾病預防控制中心建立了以PFGE技術為基礎的實驗室分子分型網(wǎng)絡體系，即PulseNet?，F(xiàn)在國際Pulse Net已經(jīng)形成由全球二十幾個國家參與的一個比較完善的網(wǎng)絡。中國于2004年建立了Pulse Net China，目前正在建立包括中國疾病預防控制中心傳染病所中心實驗室和分布于各省／市的網(wǎng)絡實驗室的一個全國性疾病監(jiān)測網(wǎng)絡。

PFGE較其它方法具有重復性好、分辨率高、結(jié)果穩(wěn)定、實驗室間結(jié)果易于比對等優(yōu)點；但是，PFGE也存在著費時費力，實驗費用較高，需要對操作人員進行專門的培訓等不足。另外，應用PFGE分型結(jié)果產(chǎn)生的是條帶，不是序列，所以在解釋時要非常慎重。

2 多位點序列分析

多位點序列分型（Multilocus sequence typing，MLST）是由多位點酶電泳（Multilocus enzyme electrophoresis，MLEE）改進而來的一種細菌分型技術。MLEE是根據(jù)多種代謝相關酶的電泳遷移率的不同來反映生物個體間遺傳基礎的差異，該法的不足之處在于實驗結(jié)果不能在各個實驗室間進行比較。MLST通過分析多個管家基因（Housekeeping gene）的內(nèi)部片段的核酸序列，從而對菌株的等位基因進行多樣性的比較，不同的菌株對應不同的序列型（Sequence－typing，ST），通過比較 ST可以發(fā)現(xiàn)菌株之間的相關性。

MLST最初是由Maiden等［9］用于腦膜炎奈瑟菌的分型，后來逐漸應用于其他菌。2006年，Ahmed等［10］首次將MLST技術用于鉤端螺旋體分型，他們選取了4個管家基因（adk、icd A、Lip L32、rrs2）和兩個候選基因（secY ，Lip L41）設計引物，對120株鉤體菌株（包括41株代表不同地方來源的標準菌株）進行基因分型。結(jié)果顯示，所選取的6個基因中，adk，icd A 和sec Y 高度可變，Lip L32，rrs2和Lip L41中度可變。MLST可用于分子流行病學和種群結(jié)構(gòu)以及生物進化方面的研究。2007年，Thaipadungpanit等［11］采用 MLST對分離自人和儲存宿主的鉤端螺旋體進行分析。他們選取了pnt A、suc A、pfk B、tpia、mreA、glum 和fad D 這7個基因。研究發(fā)現(xiàn)，來自泰國東北部的101株人體分離株產(chǎn)生了12個序列型（ST），ST34占分離株的76%。在2000－2001年鉤體病暴發(fā)的高峰期間，ST34占所有菌株的85%。ST34在同時期分離自泰國其他地方的菌株中也占優(yōu)勢。此外，7株分離自儲存動物的菌株也顯示為ST34，只有一株顯示為另一序列型。所有顯現(xiàn)為ST34的分離株都確認為鉤端螺旋體問號基因型秋季血清型。但不是所有的秋季型分離株都屬于ST34。相比之下，73株參考菌株產(chǎn)生了59個ST，但沒有ST34，從而為這次鉤體病的暴發(fā)溯源提供了線索。

MLST的主要優(yōu)點有操作簡單、重復性好、有良好的可比性等等。不足之處在于要預先知道待測微生物的基因組序列，以便進行引物的設計；另外就是測序的費用相對較高。

3 多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復序列分析

可變數(shù)目串聯(lián)重復序列（Variable number of tandem repeat，VNTR）是染色體基因組上有一定排列規(guī)律的DNA短序列，也稱小衛(wèi)星序列。其特點是種類多、分布廣、有高度的多態(tài)性、重復性和個體特異性。細菌的基因組中存在大量VNTR，分布在基因組的不同位置，將多個這樣不同的位點聯(lián)合起來進行分析可大大提高鑒別能力，該方法即為多位點可變數(shù)量串聯(lián)重復序列分析（Multiple locus VNTR analysis，MLVA）。MLVA的原理是利用與VNTR位點側(cè)翼區(qū)互補的寡核苷酸引物相對應DNA進行PCR擴增，由擴增條帶分子量來推測重復單位的拷貝數(shù)，然后對多組數(shù)據(jù)進行聚類分析［12］。MLVA 因 其 操 作 簡 單 快 速、僅 需 少 量DNA、實驗結(jié)果數(shù)據(jù)化，不同實驗室間具有可比性等，顯示出較好的應用前景。

MLVA技術的難點之一在于VNTR位點的選擇。VNTR位點作為基因分型的標記物，是決定該方法分辨力高低的關鍵因素［12］。2005年，Majed等［13］基于問號鉤端螺旋體賴型56601株的基因組序列，選取了44個VNTR位點進行PCR分析，結(jié)果有七個位點 （VNTR4、VNTR7、VNTR9、VNTR10、VNTR11、VNTR19、VNTR23）證實可用來做問號鉤體血清學分型、流行病學和系統(tǒng)發(fā)生學研究。研究發(fā)現(xiàn)，L．biflexa和L．meyeri 7個VNTR位點PCR結(jié)果陰性，MLVA方法可以區(qū)分51株中的43株問號鉤端螺旋體菌株。2005年，Slack等［14］以問號鉤端螺旋體哥本哈根型FiL1－130菌株基因組為參考，最初篩選出53個VNTR位點，用39株標準鉤端螺旋體菌株選出多態(tài)性較好的25個位點，再用98株問號鉤端螺旋體澳洲型標本鑒定是否具有型間的高多態(tài)性，最后確定6個多態(tài)性較好的位點（V8、V27、V29、V30、V36、V50），多態(tài)性指數(shù)介于0．80～0．93之間，98株澳洲型菌株被聚為3大類，其中2類存在明顯的地域聚集性，而第3類菌株具有地區(qū)多樣性。2006年，Slack等［15］重新設計引物，并改變了PCR條件，與多重熒光標記的毛細管電泳聯(lián)合，將這種改進的MLVA方法應用到之前鑒定過的96株問號鉤體澳洲型分離株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在每個VNTR位點有6～13個等位基因，而在之前的實驗中有3～8個。Hunter－Gaston平均變異指數(shù)是0．654，原來是0．599；變異的增長很大程度上歸因于對VNTR數(shù)據(jù)的分析。與熒光擴增片段長度多態(tài)性（fluorescent amplified fragment length polymorphism，F(xiàn)AFLP）分析相比，兩種分型方法得到的圖譜具有很高的一致率，而MLVA比FAFLP更能顯示一些獨特的分型模式。MLVA法的數(shù)據(jù)分析簡單，只需5個等位基因，而FAFLP卻需要150～200個等位基因。MLVA的另一個優(yōu)點是不用培養(yǎng)鉤體活菌，可直接對鉤體PCR陽性的DNA提取物進行分型。

2006 年，Salaün等［16］以 L．interrogans 賴 型56601、哥本哈根型 Fi L1－130 和L．borgpetersenii哈焦型L550基因組為參考，重新設計引物，對99株鉤端螺旋體參考菌株進行檢測。研究發(fā)現(xiàn)，VNTR4、VNTR7和VNTR10可以成功擴增并區(qū)分92%L．interrogans菌株和90%L．kirschneri菌株。對于VNTR7擴增陰性而VNTR4、VNTR10成功擴增的23株L．borgpetersenii，重新篩選位點設計引物，研究發(fā)現(xiàn)VNTR－Lb4和VNTR－Lb5可以區(qū)分60%的L．borgpetersenii菌株。我國張翠彩等［17］選用 VNTR4、VNTR7、VNTR27、VNTR29、VNTR30、VNTR36、VNTR50這七個位點，對我國致病性鉤端螺旋體黃疸出血群菌株共117株進行檢測，聚類分析分為A、B、C3個群28種基因型，其中A 群占11．97%（14／117），B群占0．85%（1／117），C群占87．18%（102／117）；多態(tài)性指數(shù)介于0．0831與0．8005之間；MLVA基因型存在明顯的地域性。

4 擴增片段長度多態(tài)性分析

擴增片段長度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）是一種以PCR為基礎的分子標記技術。該法一般采用兩種內(nèi)切酶對純化的DNA進行切割，之后用加接頭的引物進行PCR擴增，再對擴增片段電泳后形成的圖譜進行比較，在基因組水平揭示細菌之間的多樣性。起初實驗使用放射性物質(zhì)標記的引物，現(xiàn)在多使用熒光標記的引物。AFLP具有高分辨率，重復性好等優(yōu)點：但是該法需要選擇合適的酶，也需要純化大量的DNA。

Slack等［18］應用FAFLP對15株Topaz分離菌株（其中2株分離自動物）進行流行病學研究。Topaz是一個新發(fā)現(xiàn)的鉤體血清型，屬于L．weilii基因種。研究出現(xiàn)了5個主要進化支和13個獨特的FALFP圖譜。每個進化支都包括分離自不同年份的菌株，而且這些菌株在分離地點上表現(xiàn)出地理聚集性。兩株動物分離株的圖譜與兩株人體分離株的圖譜表現(xiàn)出高度的相關性，從而推測人感染此型的鉤體與帶菌動物有關。Nalam等［19］采用熒光擴增片段長度多態(tài)性分析（FAFLP）對分離自不同宿主的271株菌株進行種水平的鑒定并用于構(gòu)建基因關系圖。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AFLP是暴發(fā)調(diào)查和對分離菌株進行聚類分析的重要方法，進行聚類分析時基于菌株的地理分布比基于基因種類型更有力。但是，F(xiàn)AFLP用于分型還不夠，不能取代血清學分型。

5 應用LPS生物合成基因選擇性PCR擴增對鉤端螺旋體進行分型

該方法是近年發(fā)展起來的一種新的分型方法。研究發(fā)現(xiàn)，LPS生物合成操縱子rfb的核苷酸序列在相同基因種不同血清型的鉤體上是不同的，核苷酸序列的不同決定了LPS結(jié)構(gòu)上的差異，而后者是血清型分類的基礎?；谶@一點，Silva等［20］設計了與LPS生物合成多態(tài)位點rfb序列互補的8對引物，目的是擴增出不同的片段。結(jié)果，一半的引物對產(chǎn)生了血清型特異性的擴增產(chǎn)物，證明該種方法可以對一些血清型進行鑒定和分組。雖然目前這種方法研究的較少，應用也不夠普遍，現(xiàn)在還不夠成熟，但是隨著研究的不斷深入，它很可能成為一種將血清學分類和基因分類聯(lián)系起來的有力工具。

6 其它方法

限制性內(nèi)切酶圖譜法（REA）其基本原理是利用核酸限制性內(nèi)切酶對染色體DNA進行切割，產(chǎn)生的酶切片段再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進行分離。通過分析酶切片段的不同，可以對菌株進行分類研究。2001年，Venkatesha和 Ramadass［21］對來自19株不同血清群的問號鉤體菌和2株雙曲鉤體菌株的DNA做限制性內(nèi)切酶圖譜分析，證明各群型鉤體的酶切圖譜彼此不同，應用REA可對鉤體進行血清型水平的鑒定。REA需要培養(yǎng)大量的菌，而且實驗產(chǎn)生的大量條帶使得結(jié)果的解釋和各實驗室間數(shù)據(jù)很難比對［1］。

隨機擴增多態(tài)性DNA 隨機擴增多態(tài)性DNA（Randomly amplified polymorphic DNA ，RAPD）又稱任意引物 PCR（arbitrarily primed PCR，APPCR）或隨機引物PCR（random primer PCR，RPPCR），是一種利用非特異序列的寡聚核苷酸鏈作引物，對基因組DNA進行PCR擴增的技術。1997年，Pamadass等［22］對屬于不同血清型的14株鉤體菌株進行RAPD分析，結(jié)果每個血清型都產(chǎn)生了獨特的可區(qū)分的指紋圖譜。Corney等［23］應用RAPD指紋圖譜方法對46株致病性鉤體菌株進行分析，研究結(jié)果根據(jù)這46株菌產(chǎn)生的圖譜可將它們分成8組。RAPD（或者AP－PCR）可對鉤體進行鑒定和流行病學研究，但該法重復性較差而且各實驗室間進行數(shù)據(jù)的比對也很困難。

7 結(jié) 語

在鉤端螺旋體病流行和暴發(fā)時，需要對分離菌株進行快速準確分型。分型的意義主要體現(xiàn)在（1）在流行病學方面，追蹤傳染源、確定傳播媒介和宿主，及時控制疫情；（2）不同血清型的鉤體致病性不同，分型有助于臨床診斷和治療；（3）有助于研究菌株的進化關系及疫苗的研制。

用于鉤體分型的各種分型方法各有優(yōu)勢，但是還沒有一種方法將分辨力高，重復性好，可比性強，結(jié)果易解釋，操作簡單，費用低，實驗周期短等優(yōu)點結(jié)合起來。在實際應用中，我們要結(jié)合實際需要以及實驗室的條件，選擇合適的方法對分離得到的菌株進行分型。因為用一種方法分型得到的結(jié)果可能存在一定的片面性，所以最好用兩種或多種方法協(xié)同分型。

［1］Cerqueira GM，Picardeau M．A century of Leptospira strain typing［J］．Infection，Genetics and Evolution，2009，9：760－768．

［2］Cachay ER，Vinetz JM．A global research agenda for l eptospiosis［J］．Postgrad Med，2005，51（3）：174－178．

［3］嚴杰，戴保民，于恩庶．鉤端螺旋體病學［M］．北京：人民衛(wèi)生出版社，2006．

［4］Slack AT，Khairani－Bejo S，Symonds ML，et al．Leptospira kmetyi sp．nov．，isolated from an environmental source in Malaysia［J］．International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2009，59：705－708．

［5］Herrmann JL，Bellenger E，Perolat P，et al．Pulsed－field gel electrophoresis of Not I digests of Leptospiral DNA：a rapid method of serovar identification［J］．Clin Microbiol，1992，30：1696－1720．

［6］蔣秀高，肖玉春，聶一新，等．致病性鉤端螺旋體脈沖場凝膠圖譜分型研究［J］．中華微生物學和免疫學雜志，2001，21（4）：378－381．

［7］Galloway RL，Levett PN．Evaluation of a modified pulsed－field gel electrophoresis approach for the identification of Leptospira serovars［J］．Am J Trop Med Hyg，2008，78：628－632．

［8］Romero EC，Blanco RM，Galloway RL，Application of pulsedfield gel electrophoresis for the discrimination of Leptospiral isolates in Brazil［J］．The Society for Applied Microbiology，2009（48）：623－627．

［9］Maiden MC，Spratt BG，F(xiàn)eil E，et al．Multilocus sequence typing：a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（6）：3140－3145．

［10］Ahmed N，Devi SM，Valverde Mde L，et al．Multilocus sequence typing method for identification and genotypic classification of pathogenic Leptospira species ［J］．Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials，2006，5：28．

［11］Thaipadungpanit J，Wuthiekanun V，Chierakul W，et al．A dominant clone of Leptospira interrogans associated with an outbreak of human Leptospiosis in Thailand［J］．Plos Neglected Tropical Diseases，2007，1（1）：e56．

［12］張翠彩，蔣秀高．多位點串聯(lián)重復序列分析在鉤端螺旋體基因分型和流行病學中的應用［J］．中華流行病學雜志，2008，29（4）：405－408．

［13］Majed Z，Bellenger E，Postic D，et al．Identification of Variable－number tandem－repeat loci in Leptospira interrogans sensu stricto［J］．Clin Microbiol，2005，43（2）：539－545．

［14］Slack AT，Symonds M，Dohnt M，et al．Development of a multiple－locus variable number of tandem repeat analysis（MLVA）for Leptospira interrogans and its application to Leptospira interrogans serovar Australis isolates from Far North Qneensland，Australia［J］．Ann Clin Microbiol Antimicrob，2005，30（6）：4－10．

［15］Slack AT，Symonds M，Dohnt M，et al．An improved multiple locus variable number of tandem repeats analysis for Leptospira interrogans serovar Australis：a comparison with fluorescent amplified fragment length polymorphism analysis and its use to redefine the molecular epidemiology of this serovar in Queensland，Australia ［J］．Med Microbiol，2005，55（11）：1549－1557．

［16］Salün L，M rien F，Gurianova S，et al．Application of multilocus variable－number tandem－repeat analysis for molecular typing of the agent of Leptospiosis［J］．Clin Microbiol，2006，44（11）：3954－3962．

［17］張翠彩，聶一新，李秀文，等．黃疸出血群鉤端螺旋體 MLVA分型研究［J］．中華微生物和免疫學雜志［J］，2009，29（12）：1144－1147．

［18］Slack AT，Symonds ML，Dohnt MF，et al．Epidemiology of Leptospira weilii serovar Topaz infections in Australia［J］．Commun Dis Intell，2007，31：216－222．

［19］Nalam K，Ahmed A，Devi SM，et al．Genetic affinities within a large global collection of pathogenic Leptospira：implications for strain identification and molecular epidemiology ［J］．Plos One，2010，5（8）：e12637．

［20］Silva JB，Carvalho E，Hartskeerl RA，et al．Evaluation of the use of selective PCR amplification of LPS biosynthesis genes for molecular typing of Leptospira at the serovar level［OL］．http：／／www．springerlink．com／content／l1k883n53380pq68／，2010．

［21］Venkatesha MD，Ramadass P．Identification of Leptospiral isolates by bacterial restriction endonuclease analysis （Brenda）［J］．Indian Journal of Medical Microbiology，2001，19（2）：83－86．

［22］Ramadass P，Meerarani S，Venkatesha MD，et al．Characterization of Leptospiral serovars by randomly amplified polymorphic DNA fingerprinting［J］．International Journal of Systematic Bacteriology，1997，575－576．

［23］Corney BG，Colley J，Graham GC．Simplified analysis of pathogenic Leptospiral serovars by random amplified polymorphic DNA fingerprinting［J］．Med Microbiol，1997，46：927－932．

R377．5

A

1002－2694（2011）11－1024－04

蔣秀高：Email：jiangxiugao＠icdc．cn

中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，昌平102206

2011－04－26；

2011－07－21