王書美，呂 丹，陳 煒，張曉娟，曹興水，張連峰，2

（1.中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，北京 100021；2.中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，中國醫(yī)學科學院和北京協(xié)和醫(yī)學院，北京 100021）

Calponin 1（CNN1）基因編碼的堿性調(diào)寧蛋白（calponin 1，CNN1）是一個首先從雞砂囊和牛主動脈中分離出的相對分子質(zhì)量為3.4×104的堿性蛋白［1，2］。它主要在平滑肌細胞中表達，具有很強的組織特異性，結(jié)合肌動蛋白，原肌球蛋白，鈣調(diào)蛋白［1，3，4］，抑制肌球蛋白的ATP酶活性［5］，在固定化的肌球蛋白抑制Ca2+-依賴的肌動蛋白的移動性［6］，誘導肌動蛋白絲的構(gòu)象改變［7］，參與平滑肌收縮。

20世紀90年代，CNN1作為平滑肌分化的標記，研究主要集中在其結(jié)合肌動蛋白，抑制肌球蛋白ATP酶（myosin ATPase，簡稱ATP酶）方面。近年來，發(fā)現(xiàn)CNN1可調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架的穩(wěn)定性，認為CNN1可作為重要的信號轉(zhuǎn)導和整合分子［8］?，F(xiàn)在研究也表明CNN1不僅作為平滑肌分化的可靠標記，還可預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移及患者的預(yù)后情況。其表達改變與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，研究其生化特征及生化分子機制，能為預(yù)防和治療平滑肌疾病及腫瘤，提供理論與實驗基礎(chǔ)。

在鼠類胚胎發(fā)育過程中，在9.5d胚胎的背主動脈，心臟流出管道，管型心臟中可監(jiān)測到CNN1，隨后的發(fā)育過程中血管平滑肌組織中CNN1表達上調(diào)，而在心臟中的表達下調(diào)至檢測不到的水平，表明CNN1參與心肌纖維發(fā)育，調(diào)節(jié)胚胎期心臟的收縮［9］。Tan等［10］基因芯片結(jié)果中顯示心力衰竭患者中CNN1表達比非心力衰竭者下調(diào)，本實驗也發(fā)現(xiàn)cTnTR141W擴張型心肌病模型小鼠心臟中CNN1表達比野生型小鼠降低，推測其對心臟發(fā)育及心血管系統(tǒng)可能具有重要的作用。CNN1過表達對心臟會有怎樣的影響，對心臟的發(fā)育是有利還是不利的，本文因此建立了心臟特異表達CNN1的轉(zhuǎn)基因小鼠，以對其生理功能，特別是對心臟正常發(fā)育可能存在的作用進行初步研究。

1 材料和方法

1.1 CNN1表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因小鼠的制備

以pBluescriptR-CNN1質(zhì)粒（Open Biosystems，美國，Clone ID4824832）為模板，用PCR法擴增人CNN1全長cDNA，將擴增片段插入pMD18T載體，經(jīng)測序并比對正確無突變堿基后，以Sal I（寶生物工程有限公司，中國）酶切回收CNN1片段，并克隆入α-MHC啟動子下游構(gòu)建心臟特異CNN1表達載體。提取并酶切鑒定質(zhì)粒正確后，用Not I將其線性化，SephedexG50柱純化DNA片段，獲得α-MHC啟動的CNN1基因的轉(zhuǎn)基因片段，注射前將轉(zhuǎn)基因片段的濃度調(diào)整至5ng/μL，用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因表達載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中（小鼠購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所，康藍公司XCXK京2004001），用ICR小鼠作假孕受體（本實驗室飼養(yǎng)），制備轉(zhuǎn)基因小鼠（TE2000U顯微注射儀）［11］。實驗中涉及動物的操作程序已經(jīng)得到中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準（GC-08-2035）。

1.2 PCR法鑒定CNN1轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型

轉(zhuǎn)基因小鼠在出生9～14d用剪趾法編號，收集剪下的組織，用堿裂解法提取基因組DNA［12］，用PCR法對轉(zhuǎn)基因小鼠進行基因型檢測。PCR上游引物為：5′AAGGGCGGAACATCATTGGGCT 3′，下游引物為：5′CTCGAAGATCTGCCGCTTGGT 3′（invitrogen）。PCR反應(yīng)體系20μL（試劑購自寶生物工程有限公司，中國）。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環(huán)。CNN1目的片段為215bp。

1.3 Western Blot

將小鼠脫頸椎處死后，取100mg心臟組織加入1mL預(yù)冷的蛋白裂解液，冰上充分研磨，之后冰上靜置30min，再將組織勻漿于4℃，12000r/min離心30min，吸取上清即為心臟組織總蛋白。取50μg蛋白，12％的SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到0.45μm硝酸纖維素NC膜上（Millipore，美國）。將NC膜放入5％脫脂奶粉封閉液，室溫下置搖床上封閉1h，再用TBST稀釋的兔抗人Calponin 1單克隆抗體（ab46794，Abcam公司，美國）（1∶20000稀釋），4℃雜交過夜。次日，TBST洗3次，每次5min。將膜轉(zhuǎn)移到TBST稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體（Pierce，美國）（1∶15000），室溫雜交1h，采用HRP-GAPDH作為內(nèi)參（康成生物，中國），TBST洗3次，每次5min。將膜置于化學發(fā)光液中，X-ray膠片曝光、顯影及定影。

1.4 超聲檢查CNN1轉(zhuǎn)基因小鼠

選用3月齡的轉(zhuǎn)基因陽性和同窩陰性對照小鼠，用三溴乙醇（0.2mL/10g體重）麻醉，脫去心前區(qū)的被毛，選用30Hz的探頭，按Zhou［13］報道的方法進行心臟超聲影像分析（Vevo770小動物超聲探測系統(tǒng)，加拿大）。

1.5 組織學檢測

選用6月齡的轉(zhuǎn)基因陽性和同窩陰性對照小鼠，頸椎脫臼法犧牲小鼠，打開胸腔取出心臟，將心臟組織固定在中性福爾馬林中24h，進行脫水、包埋、切片、HE染色和Masson染色。

1.6 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)SPSS統(tǒng)計軟件處理。先進行數(shù)據(jù)的方差齊性檢驗，組間比較采用獨立性t檢驗。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 CNN1基因在小鼠心臟組織中的表達

分別提取新生、14d，30d，90d的野生型小鼠，3月齡cTnTR141W和cTnTR92Q轉(zhuǎn)基因小鼠［14，15］的心臟組織總蛋白，用Calponin 1單克隆抗體進行Western Blot分析，結(jié)果CNN1在不同年齡的野生型小鼠心臟中均有表達，且表達隨小鼠年齡的增長略有下調(diào)（圖1A），同時發(fā)現(xiàn)CNN1在擴張型心肌病模型小鼠心臟中表達降低，肥厚型心肌病模型小鼠心臟中表達升高（圖1B）。

圖1 CNN1基因在小鼠心臟組織中的表達Fig.1 Expressions of CNN1 gene in the heart tissues

圖2 CNN1轉(zhuǎn)基因小鼠的建立Fig.2 Generation of CNN1 transgenic mice

2.2 CNN1轉(zhuǎn)基因小鼠的建立

用PCR法克隆人CNN1基因，測序結(jié)果顯示克隆的cDNA同已報道的CNN1序列完全一致（GenBank No.NM_001299.4），將CNN1基因插入心臟特異表達的α-MHC啟動子下游，構(gòu)建α-MHCCNN1轉(zhuǎn)基因表達載體（圖2A）。用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因表達載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，轉(zhuǎn)入受體假孕ICR小鼠中，小鼠出生14d提取基因組DNA，用PCR擴增CNN1基因215bp目的片段，鑒定CNN1轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型（圖2B），共得到4只首建鼠，且均可傳代。分別提取CNN1首建鼠的F1代陽性轉(zhuǎn)基因小鼠和同齡陰性對照小鼠心臟組織總蛋白，用CNN1單克隆抗體進行Western Blot分析，結(jié)果顯示5號及6號首建鼠心臟組織內(nèi)CNN1蛋白表達量明顯高于同齡陰性對照小鼠（圖2C）。

2.3 超聲檢查CNN1轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟幾何構(gòu)型及心功能

將3月齡的CNN1轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩陰性對照小鼠進行心臟超聲影像分析（表1，圖3），結(jié)果顯示，CNN1轉(zhuǎn)基因小鼠收縮期左室內(nèi)徑（LVID，systolic）增加28％（P＜0.01，n=12），舒張期左室內(nèi)徑（LVID，diastolic）增加16.2％（P＜0.01，n=12），收縮期左室后壁厚度（LVPW，systolic）減小15.7％（P＜0.01，n=12），舒張期左室后壁厚度（LVPW，diastolic）減小21％（P＜0.01，n=12），射血分數(shù)EF（ejection fraction）降低11.5％（P＜0.01，n=12），短軸縮短率FS（fraction shortening）降低14.6％（P＜0.05，n=12）。

表1 3月齡CNN1轉(zhuǎn)基因小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能M型超聲分析（n=12）Tab.1 The cardiac structure and function analysis of 3-month transgenic mice by M-mode echocardiograph（n=12）

2.4 CNN1轉(zhuǎn)基因小鼠心臟病理檢查

將6月齡CNN1轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩陰性對照小鼠的心臟進行病理解剖，并進行HE染色和Masson染色。HE染色可見CNN1轉(zhuǎn)基因小鼠心臟全心擴大，心臟室壁明顯變薄，心腔變大（圖4A，B），高倍鏡下可見心肌細胞不均勻肥大，細胞間隙變大（圖4C，D），Masson染色可見CNN1轉(zhuǎn)基因小鼠心臟心肌間質(zhì)纖維明顯增多（圖4E，F(xiàn)）。（圖見封3）

3 討論

Calponins是肌動蛋白結(jié)合蛋白家族，在脊椎動物細胞中廣泛表達。按其等電點（isoelectric point，pI）分為堿性調(diào)寧蛋白（h1 calponin，CNN1，pI 8～10），中性調(diào)寧蛋白（h2 calponin，h2CaP，pI 7～8），酸性調(diào)寧蛋白（h3 calponin，h3CaP，pI 5～6）［16］。這3個成員的前273個氨基酸殘基具有很高的同源性（＞70％），都是由單一CH結(jié)構(gòu)域（calponin homologydomain）和29個氨基酸殘基組成的CLR（calponin-like repeat）三拷貝串聯(lián)重復序列組成。但它們的羧基末端序列有較大的差異［17］。堿性調(diào)寧蛋白大多表達于終末分化和非增殖性的平滑肌細胞中，其在平滑肌組織中的含量與原肌球蛋白（tropomyosin）相似，為肌動蛋白的1/7。中性調(diào)寧蛋白主要分布于心肌組織中。酸性調(diào)寧蛋白是一種無組織表達特異性的變異體，其在腦組織中含量最豐富。

本文利用Western Blot檢測了CNN1在野生型小鼠心臟中的時程表達，出生后的小鼠心臟中均檢測到了CNN1的表達，并發(fā)現(xiàn)CNN1在cTnTR141W擴張型心肌病小鼠模型中的表達比野生型小鼠低，推測其對心臟發(fā)育及心血管系統(tǒng)可能具有重要的作用。

本文中，首建鼠Founder 5和Founder 6的后代小鼠PCR檢測結(jié)果顯示外源基因能穩(wěn)定地傳遞到下代。Western Blot結(jié)果顯示，CNN1在5號和6號首建鼠心臟組織中與野生型小鼠相比有較高表達，表明成功建立了心臟特異表達的α-MHC-CNN1轉(zhuǎn)基因小鼠。

我們建立的心臟特異表達CNN1的轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟超聲影像分析結(jié)果顯示，與野生型小鼠心臟相比，收縮期和舒張期左室內(nèi)徑增加，收縮期和舒張期左室后壁厚度變薄，射血分數(shù)和短軸縮短率降低。心臟組織病理觀察結(jié)果顯示，CNN1轉(zhuǎn)基因小鼠心臟全心擴大，心臟室壁明顯變薄，心腔變大，高倍鏡下可見CNN1轉(zhuǎn)基因小鼠心肌細胞不均勻肥大，細胞間隙變大，心肌間質(zhì)纖維明顯增多。

圖3 CNN1轉(zhuǎn)基因小鼠M型超聲分析截圖Fig.3 Analysis of the mouse heart by echocardiography

目前，關(guān)于心臟特異表達CNN1的轉(zhuǎn)基因小鼠尚未見報道，本文成功建立了心臟特異表達的α-MHC-CNN1轉(zhuǎn)基因小鼠，實驗發(fā)現(xiàn)，CNN1過表達可使心臟發(fā)生心腔增大，室壁變薄，心臟收縮功能減弱等改變，此轉(zhuǎn)基因小鼠的建立為進一步研究CNN1對心臟正常發(fā)育，以及對CNN1在心臟發(fā)育和心肌病的發(fā)生過程中的生物學功能及可能的機制加以研究，提供了有價值的模型動物。

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