張成標(biāo)，潘志強(qiáng)，劉勇林

(徐州醫(yī)學(xué)院1.江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、2.生理學(xué)教研室，江蘇徐州 221002)

腎臟髓袢升支粗段(thick ascending limb，TAL)對(duì)NaCl的主動(dòng)重吸收啟動(dòng)了髓質(zhì)滲透梯度的形成，其動(dòng)力來自管周膜上的鈉－鉀泵。50pS鉀通道是管周膜上分布最多的鉀通道［1－2］，在NaCl的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用。50pS鉀通道的活性是否受鈉－鉀泵活動(dòng)的影響，目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)利用單通道膜片鉗技術(shù)，觀察鈉－鉀泵抑制劑ouabain對(duì)髓袢升支粗段管周膜50pS鉀通道活動(dòng)的影響，探討50pS鉀通道是否在功能上與鈉－鉀泵偶聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 腎小管的分離 SD大鼠，體質(zhì)量70～120 g，♀♂不拘。由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠經(jīng)10%的水合氯醛(400 mg·kg－1)腹腔麻醉后，立即打開腹腔取出腎臟，去除包膜，從腎臟的中間部分用刀片切出厚約0.5～1 mm的冠狀切片，浸入濃度為1 g·L－1膠原酶溶液，放進(jìn)37℃恒溫水浴箱中消化45～55 min。在解剖顯微鏡下分離出腎小管髓袢升支粗段，放在涂有多聚賴氨酸的載玻片(5 mm×5 mm)上固定，并移送至已加入浴液的膜片鉗系統(tǒng)的細(xì)胞記錄槽中。

1.2 膜片鉗單通道記錄 用P-97型微電極拉制儀(Sutter，美國)四步拉制玻微電極，微電極尖端的直徑約為0.5～1.0 μm，拉制完成后再適度拋光。在內(nèi)充電極內(nèi)液時(shí)，電極的入液電阻為10～30 MΩ。

選取清潔、光滑、完整的腎小管進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)主要采用細(xì)胞貼附式(cell-attached)單通道電流記錄方法。對(duì)經(jīng)膠原酶消化過的髓袢升支粗段腎小管的管周膜進(jìn)行封接，形成高阻封接后即形成細(xì)胞貼附式記錄模式。實(shí)驗(yàn)使用的膜片鉗系統(tǒng)為Multiclamp 700B膜片鉗放大器(Axon公司，美國)和Digidata 1440A模－數(shù)轉(zhuǎn)換器(Axon公司，美國)，記錄和分析軟件為pCLAMP 9.2(Axon公司，美國)。采樣頻率為10 kHz，濾波頻率為0.2 kHz。用通道總開放概率NPo作為衡量通道活性大小的指標(biāo)，它是單個(gè)通道開放概率(open probability，Po)與通道開放數(shù)(N)的乘積，其數(shù)值可用公式NPo=Σ(1×t1+2×t2+…+i×ti)計(jì)算。公式中的i表示通道開放的電流水平，在該水平有i個(gè)通道同時(shí)開放;ti表示通道在該水平開放的持續(xù)時(shí)間占總時(shí)間的分?jǐn)?shù)。

1.3 實(shí)驗(yàn)溶液及藥品 電極內(nèi)液(mmol·L－1):KCl 140，MgCl21.8、HEPES 10(pH=7.4)。浴液(mmol·L－1):NaCl 140、KCl 5、CaCl21.8、MgCl21.8、HEPES 10(pH=7.4)。膠原酶(collagenase type IA，購于Sigma公司)溶液在每次實(shí)驗(yàn)時(shí)臨時(shí)配制，每次稱取1～2 mg，用浴液稀釋成濃度為1 g· L－1的酶溶液。Ouabain(購于Sigma公司)先用浴液配制成一定濃度的母液，實(shí)驗(yàn)時(shí)用微量加樣器抽取一定量的母液加入細(xì)胞記錄槽，使浴液的藥物濃度達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

2 結(jié)果

2.1 記錄通道類型及電導(dǎo)大小的確定［5］實(shí)驗(yàn)中記錄到的單通道電流能被鉀通道阻斷劑Ba2+阻斷，證明其是鉀通道電流。單通道電流大小隨著鉗制電壓的變化而變化，以電壓為橫坐標(biāo)、電流為縱坐標(biāo)作出電流－電壓(I-U)曲線，根據(jù)曲線斜率計(jì)算出通道電導(dǎo)約為50pS。

2.2 Ouabain對(duì)髓袢升支粗段管周膜50pS鉀通道活性的影響 在細(xì)胞貼附式記錄模式下，先記錄3～5 min，然后向浴槽內(nèi)加入一定量的ouabain母液，使浴液中的ouabain濃度達(dá)到20 μmol·L－1，結(jié)果通道開放概率(NPo)從加藥前的0.43±0.28降低到0.01±0.02(n=7，P＜0.01)，將ouabain洗脫后NPo恢復(fù)到0.40±0.32(n=7，P＜0.01)，表明20 μmol·L－1的ouabain對(duì)50 pS鉀通道具有可逆性抑制效應(yīng)。

劑量－效應(yīng)關(guān)系研究顯示，ouabain對(duì)50 pS鉀通道的抑制作用與其濃度正相關(guān)(Tab 1)。

Tab 1 Effects of different ouabain concentration on NPo of the basolateral 50pS K+channels incell-attached patchs(±s，n=7)

Tab 1 Effects of different ouabain concentration on NPo of the basolateral 50pS K+channels incell-attached patchs(±s，n=7)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs pre-addition of ouabain group

Post-addition of ouabain 0 μmol·L－1 Ouabain concentration Pre-addition of ouabain 0.38±0.13 0.36±0.13 5 μmol·L－1 0.36±0.18 0.17±0.09* 10 μmol·L－1 0.32±0.19 0.06±0.03＊＊20 μmol·L－1 0.43±0.28 0.01±0.02＊＊

3 討論

腎臟髓袢升支粗段具有重要功能，因?yàn)樗粌H重吸收20%～25%的Na+、Cl－和K+，更重要的是，髓袢升支粗段對(duì)Na+和Cl－的主動(dòng)重吸收是髓質(zhì)滲透梯度建立的直接動(dòng)力，在尿液的濃縮和稀釋方面發(fā)揮重要作用。髓袢升支粗段對(duì)NaCl主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的原動(dòng)力來自管周膜上的鈉－鉀泵，而管周膜鉀通道活動(dòng)也影響了髓袢升支粗段對(duì)NaCl的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過程。但管周膜鉀通道和鈉－鉀泵之間的相互關(guān)系及其作用機(jī)制尚未闡明。

Ouabain是特異的鈉－鉀泵抑制劑，較高濃度(微摩爾級(jí))的ouabain對(duì)鈉－鉀泵有較強(qiáng)的抑制作用，從而影響細(xì)胞內(nèi)Na+和細(xì)胞外K+逆濃度梯度的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。Ouabain還通過作用于鈉－鉀泵介導(dǎo)與細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡有關(guān)的信號(hào)傳遞［3］。此外，ouabain可作用于鈉－鉀泵影響細(xì)胞間連接的形成［4］。本研究顯示，ouabain對(duì)管周膜50pS鉀通道有抑制作用。這種作用不太可能是ouabain從膜外側(cè)對(duì)鉀通道的直接作用，因?yàn)槲覀儾捎玫氖羌?xì)胞貼附式(cell-attached)單通道記錄模式，藥物難以進(jìn)入形成高阻封接處細(xì)胞膜片的外表面;ouabain也很難進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)從膜內(nèi)側(cè)直接作用于鉀通道，因?yàn)閛uabain是水溶性物質(zhì)，不能穿越脂溶性的細(xì)胞膜。因此，ouabain對(duì)管周膜50pS鉀通道的抑制作用可能由其他間接途徑引起。我們最近的研究表明［5］，髓袢升支粗段管周膜50pS鉀通道的活動(dòng)受細(xì)胞內(nèi)ATP的調(diào)控。由于細(xì)胞內(nèi)ATP濃度與鈉－鉀泵活動(dòng)情況密切相關(guān)，因此，我們推測，ouabain對(duì)50pS鉀通道的抑制作用可能繼發(fā)于鈉－鉀泵抑制引起的細(xì)胞內(nèi)ATP濃度的降低。

本研究進(jìn)一步提示，在髓袢升支粗段細(xì)胞內(nèi)ATP濃度的變化介導(dǎo)了管周膜鉀通道和鈉－鉀泵在功能上的偶聯(lián)關(guān)系。

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