呂愛紅 朱帥科 張曉曼

鄭州市第一人民醫(yī)院 鄭州 450004

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是以學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能下降為臨床特征的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,β-淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)沉積是 AD的主要病理學(xué)特征。較多研究證實(shí)2型糖尿病影響認(rèn)知功能,而AD被認(rèn)為是一種3型糖尿病[1]。胰島素抵抗是2型糖尿病病理機(jī)制之一,本實(shí)驗(yàn)通過觀察胰島素抵抗大鼠腦海馬區(qū)Aβ的表達(dá)及認(rèn)知功能的改變,旨在探討胰島素抵抗與AD的關(guān)系,為AD的發(fā)病機(jī)制提供一定的基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 4～5周齡清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠30只,體質(zhì)量180～200 g,購(gòu)于鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。兔 Aβ40一抗(購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司),辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),血糖儀(美國(guó)強(qiáng)生公司產(chǎn)品),Morris水迷宮(北京碩林苑科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備和分組：將30只Wistar雄性大鼠,按照隨機(jī)數(shù)字表法分組,每組15只。正常對(duì)照組(NC組)給予標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料喂養(yǎng),模型組給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)(飼料成分：10%豬油,20%蔗糖,2.5%膽固醇,1%膽酸鹽,6.5%常規(guī)飼料),誘導(dǎo)出胰島素抵抗模型。

1.2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：水迷宮為一個(gè)不銹鋼圓形水池,直徑100 cm,高 60 cm,內(nèi)置無色有機(jī)玻璃平臺(tái),平臺(tái)高40 cm,在水池壁東西南北部位分別標(biāo)明入水點(diǎn)。將平臺(tái)放在西南象限正中處,迷宮中含牛奶液面高于安全平臺(tái)1 cm,水溫(22±1)℃,加適量奶粉使水呈乳白色,實(shí)驗(yàn)期間環(huán)境安靜,迷宮外參照物不變。該實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5 d,每天上下午2個(gè)時(shí)間段,每個(gè)時(shí)間段訓(xùn)練4次,每次訓(xùn)練隨機(jī)找個(gè)入水點(diǎn),將大鼠面向池壁放入水池,同一次訓(xùn)練所有大鼠入水點(diǎn)相同,記錄大鼠從入水找到平臺(tái)的時(shí)間即逃避潛伏期。如果大鼠在120 s內(nèi)沒有找到平臺(tái),將其引向平臺(tái),潛伏期計(jì)為120 s。前4 d為訓(xùn)練期,第5天進(jìn)行測(cè)試。

1.2.3 一般指標(biāo)的測(cè)定：從大鼠尾靜脈取血,用血糖儀檢測(cè)血糖。大鼠處死前心臟取血1 mL,離心留取血漿,用放射免疫法檢測(cè)胰島素。胰島素抵抗指數(shù)是以穩(wěn)態(tài)模型的胰島素抵抗指數(shù) HOMA-IR=FINS(IU/L)×FPG(mmol/L)/22.5表示。

1.2.4 組織標(biāo)本及切片制備：水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉后,開胸暴露心臟,用生理鹽水100 mL灌洗左心室,可見清涼液體從已剪開的右心耳流出,用4%多聚甲醛固定后,斷頭取腦。冠狀位切取視交叉后1～4 mm的腦組織。

1.2.5 免疫組化檢測(cè)Aβ40的表達(dá)：石蠟切片常規(guī)脫蠟,脫水,枸櫞酸鹽(p H 6.0)抗原修復(fù)液中熱修復(fù) 15 min,自然降到室溫。3%H2O2孵育15 min。山羊血清封閉切片,加入一抗Aβ40(1∶100),4℃過夜,二抗及SP試劑,用PBS代替一抗作陰性對(duì)照,未出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng),各步驟均以PBS沖洗。DAB顯色,蘇木素復(fù)染,逐層脫水,中性樹膠封片。每只大鼠取5張切片,在200倍光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行半定量分析,將每張切片隨機(jī)攝取5個(gè)視野,圖像采集后用Image-Pro Plus 6.0分析軟件測(cè)定陽(yáng)性物質(zhì)的平均光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPASS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件行t檢驗(yàn),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 空腹血糖、胰島素水平及胰島素抵抗指數(shù) IR組大鼠胰島素水平(28.8±2.8)IU/L,胰島素抵抗指數(shù)5.15±0.38,顯著高于NC組(13.2±3.7,2.17±0.24),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),而 IR組空腹血糖(5.47±0.34)較 NC組(5.59±0.36)略增高,組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)成績(jī) 與NC組的(30.61±10.8)s相比,IR組大鼠逃避潛伏期(78.56±9.1)s明顯延長(zhǎng)(P＜0.01)。

2.3 Aβ40蛋白表達(dá)結(jié)果 鏡下觀察可見 Aβ40蛋白的陽(yáng)性表達(dá)物為棕黃色沉著物。NC組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元著色較淺,神經(jīng)元細(xì)胞排列密集,表達(dá)呈弱陽(yáng)性;與NC組相比,神經(jīng)元細(xì)胞排列稀疏,IR組呈深棕黃色,染色較深,表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性。2組Aβ40蛋白平均光密度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

3 討論

胰島素抵抗是指胰島素維持正常血糖能力下降的現(xiàn)象,臨床特征為高胰島素血癥,但尚未發(fā)展至2型糖尿病階段。高脂高糖飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗模型更接近人類的發(fā)病機(jī)制,本研究通過喂養(yǎng)大鼠高脂高糖飲食12周后檢測(cè)2組大鼠血糖水平,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而IR組大鼠血漿胰島素水平、胰島素抵抗指數(shù)較正常對(duì)照組增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明胰島素抵抗模型建立成功。本實(shí)驗(yàn)中采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察大鼠的認(rèn)知行為改變,與對(duì)照組相比,胰島素抵抗組大鼠逃避潛伏期延長(zhǎng),提示胰島素抵抗大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力下降。有研究證實(shí)胰島素、胰島素受體及胰島素敏感的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白選擇性分布于腦內(nèi)認(rèn)知功能區(qū),如海馬區(qū),胰島素參與調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)和記憶功能,在大鼠腦室內(nèi)注射胰島素能夠提高大鼠的被動(dòng)逃避能力,給AD患者靜脈內(nèi)注射胰島素能改善記憶功能,因此,本研究胰島素抵抗大鼠的認(rèn)知功能下降,推測(cè)胰島素的相對(duì)缺乏是導(dǎo)致認(rèn)知功能下降的主要因素。

在AD發(fā)病過程中,Aβ是由 APP先后被β,γ-分泌酶先后裂解而產(chǎn)生,本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)2組大鼠腦內(nèi)Aβ40蛋白表達(dá),結(jié)果顯示,Aβ40在正常組大鼠腦組織有少量表達(dá),與正常組相比,IR組大鼠海馬區(qū)Aβ40蛋白的表達(dá)均較對(duì)照組明顯增多(P＜0.01)。海馬區(qū)是與認(rèn)知功能最密切的一個(gè)部位,目前,Aβ確切的功能尚不清楚,有實(shí)驗(yàn)證實(shí),不同濃度的Aβ對(duì)神經(jīng)元的影響不同,低濃度的Aβ對(duì)神經(jīng)元有營(yíng)養(yǎng)作用,高濃度的Aβ對(duì)神經(jīng)元有神經(jīng)毒性,使樹突和軸突退縮,導(dǎo)致神經(jīng)元減少或缺失,繼而引起學(xué)習(xí)、記憶功能下降等臨床癥狀[2]。在生理情況下,細(xì)胞漿內(nèi)高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)輸Aβ到細(xì)胞外,當(dāng)發(fā)生胰島素抵抗時(shí)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)糖代謝發(fā)生異常,ATP生成減少,引起神經(jīng)元細(xì)胞胞漿內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體功能下降,繼而導(dǎo)致β-淀粉樣蛋白在胞漿內(nèi)過度沉積[3]。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)從分子生物學(xué)證實(shí)胰島素抵抗能導(dǎo)致認(rèn)知功能下降,同時(shí)發(fā)現(xiàn)Aβ蛋白表達(dá)增加,因此,胰島素抵抗可能參與了AD的發(fā)生與發(fā)展。

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[3]褚文政,錢采韻.側(cè)腦室注射鏈脲霉素引起大鼠腦Aβ1-40和Aβ1-42表達(dá)增加[J]. 第四軍醫(yī)大學(xué)報(bào),2005,26(15)：1 356-1 358.