葉元康

·生物診斷技術(shù)·

革蘭染色的現(xiàn)況和進(jìn)展

葉元康

本文對經(jīng)典的革蘭染色、革蘭染色的自動(dòng)染色儀、自動(dòng)染色鑒別直讀儀和革蘭染色智能化與環(huán)保節(jié)水作一綜述和展望。

革蘭染色（Gram stain）是 1884 年由丹麥醫(yī)師 Christain Gram 創(chuàng)立，染色將細(xì)菌分為革蘭陽性菌和革蘭陰性菌兩大類，在細(xì)菌學(xué)的形態(tài)鑒定、分類和用藥選擇等方面發(fā)揮了重要的作用[1]。世界各國常用的革蘭染色為哈克改良法（Gram stain-Hucher modification），即經(jīng)典的四步法革蘭染色[2]，該染色使用 4 種試劑：結(jié)晶紫的混合液（crystal violet），碘液（iodine），酒精脫色液（alcohol decolorizer）和沙黃復(fù)染液（safranin O）。正規(guī)的染色時(shí)間約需 3 分鐘 45 秒，試劑用量約 16 ml。但是哈克改良法的 crystal violet 在半年內(nèi)就會(huì)出現(xiàn)沉淀，iodine 易自然升化，alcohol decolorizer 易揮發(fā)都是導(dǎo)致不良染色結(jié)果的重要原因。四步法革蘭染色常受染液質(zhì)量、實(shí)驗(yàn)者操作和細(xì)菌本身變化等因素影響，會(huì)將革蘭陽性菌染成紅色或革蘭陰性菌染成紫色，誤導(dǎo)或干擾實(shí)際工作，或產(chǎn)生不良后果。四步法革蘭染色步驟多，操作麻煩，易出錯(cuò)，質(zhì)量控制不易進(jìn)行，難以做到標(biāo)準(zhǔn)化[3]。

近年來，革蘭染色技術(shù)已有了不少改進(jìn)：①快速染色，時(shí)間在 45 s 左右；②三步法革蘭染色，1994 年美國 Difco公司的產(chǎn)品，將脫色與復(fù)染合二為一，可縮短染色時(shí)間、減少試劑用量、將脫色標(biāo)準(zhǔn)化和增加準(zhǔn)確性；③ 1992 年美國CSM 公司的 Gram stain enhancer 能增強(qiáng)結(jié)晶紫的染色；④以stabilized iodine取代傳統(tǒng)的碘液：穩(wěn)定碘液為polyvinylpyrrolidone（PVP）iodine 可維持有效期達(dá) 15 個(gè)月之久；⑤ 以 Gram basic fuchsin 取代 Gram safranin 染厭氧菌、彎曲菌和李氏特菌更鮮紅；⑥二步法革蘭染色，2010年中國無錫 Faye 公司的產(chǎn)品，第一步為結(jié)晶紫初染，染色6 s，第二步為碘、酒精和品紅混合液復(fù)染，染色 3 s，能得出與三步法和四步法一樣的結(jié)果。二步法革蘭染色液可穩(wěn)定12 個(gè)月，節(jié)省生產(chǎn)原料 25％、降低生產(chǎn)成本30％、物流成本 50％ 和染色節(jié)水 50％。二步法染色工作效率比三步法和經(jīng)典的四步法提高 3 ～ 4 倍[3-6]。

革蘭染色的意義：①確定細(xì)菌的染色性，染成紫色的陽性菌或紅色的陰性菌；②確定細(xì)菌的形態(tài)，有球菌、桿菌、弧菌等；③有芽胞的桿菌和絕大多數(shù)的球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈陽性；弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽胞桿菌都呈陰性；④細(xì)菌性腦膜炎、肺炎、菌尿、淋病、腦、肺、腹部的感染和創(chuàng)傷時(shí)，革蘭染色非常有用。例如疑似細(xì)菌性腦膜炎和關(guān)節(jié)炎患者的檢樣直接涂片染色發(fā)現(xiàn)病菌，可在獲得培養(yǎng)結(jié)果前提供病原的參考；泌尿生殖道的檢樣，若發(fā)現(xiàn)革蘭陰性雙球菌，可作為診斷淋病的參考；女性陰道直接涂片，根據(jù)乳酸桿菌在鏡下視野中的比例，有無滴蟲或念珠菌的假菌絲和芽生孢子，可判斷細(xì)菌性、念珠菌性或滴蟲性陰道炎；⑤分離培養(yǎng)的菌落，細(xì)菌鑒定的第一步為革蘭染色，根據(jù)染色性和形態(tài)，來確定下一步再做哪些試驗(yàn)；⑥在獲得藥敏結(jié)果前，革蘭染色可作為醫(yī)師選用抗生素的參考，革蘭陽性菌對青霉素類抗生素敏感，革蘭陰性菌對對氨基糖苷類抗生素敏感[7-8]。

鑒于革蘭染色的重要性，革蘭染色液和染色方法的質(zhì)量控制尤為重要。臨床微生物實(shí)驗(yàn)室都需要進(jìn)行革蘭染色液和染色方法的質(zhì)量控制，通常用大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行，每批試劑每周至少 1 次質(zhì)量控制，衛(wèi)生部已制定了微生物實(shí)驗(yàn)室的全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程。近年已有商品化的革蘭染色用質(zhì)量控制片，該產(chǎn)品是在玻片上涂有大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株未染部位，可監(jiān)控染色液和染色方法的誤差。商品化的革蘭染色用質(zhì)量控制片具有以下優(yōu)點(diǎn)：①節(jié)省實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行革蘭染色質(zhì)控時(shí)制備培養(yǎng)基、培養(yǎng)質(zhì)控菌株、保存質(zhì)控菌株的時(shí)間和經(jīng)費(fèi)；②可對染色液、染色方法和細(xì)菌變異進(jìn)行監(jiān)控；③可做到質(zhì)控菌培養(yǎng)的時(shí)間、涂片的菌量和制片的標(biāo)準(zhǔn)化。商品化的革蘭染色用質(zhì)量控制片是值得提倡的[9-10]。

目前國內(nèi)外對微生物和細(xì)胞的染色、鏡檢和結(jié)果處理主要是靠人工操作。人工操作需要訓(xùn)練有素的人員；人工操作樣本間誤差大，缺乏可靠性和重現(xiàn)性，有人為和系統(tǒng)影響；人工操作難以質(zhì)量控制、不易做到標(biāo)準(zhǔn)化；人工操作工作效率低；人工操作有染色廢水污染環(huán)境；人工操作水資源消耗較大。鑒于人工操作的染色、鏡檢和結(jié)果處理的缺點(diǎn)，市場上已有自動(dòng)革蘭染色儀產(chǎn)品，如生物梅里埃公司（法國，2008年）、BD 公司（美國，2009 年）和賽德利公司（西班牙，2009 年），使得革蘭染色實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化。自動(dòng)化染片能夠節(jié)約時(shí)間，保證染片的準(zhǔn)確性。無錫飛伊生物科技有限公司研制出新一代的自動(dòng)染色鑒別直讀儀（中國，2011年）克服了現(xiàn)有的自動(dòng)染色儀不能顯微照相和信息處理的不足。該儀器除能自動(dòng)進(jìn)行染色外，還能自動(dòng)鏡檢、攝像和直接放大屏顯染色結(jié)果，其 2TB 的硬盤存儲器和網(wǎng)絡(luò)聯(lián)接功能，能調(diào)取、查詢歷史資料、建立患者檔案、共享信息和做臨床會(huì)診。

革蘭染色在細(xì)菌學(xué)的形態(tài)鑒定、分類和用藥選擇有重要的作用[11-12]。革蘭染色隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步也會(huì)與時(shí)俱進(jìn)。在自動(dòng)化染色、自動(dòng)化鏡檢和圖像放大直讀的基礎(chǔ)上，今后的努力方向：①實(shí)現(xiàn)染色廢水的凈化處理和循環(huán)利用，做到環(huán)保節(jié)水；②建立臨床樣本和比對的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫，做成能智能化比對的工作站；③研制出適用于革蘭、抗酸、和血細(xì)胞染色的一機(jī)多用的新儀器。

[1] Murray P, Jo Baron E, Jorgensen J, et al. Manual of clinical microbiology. 8th ed. Washington DC: American Society for Microbiology, 2003.

[2] Dong XZ, Cai MY. Manual identification of common bacterial system. Beijing: Science Press, 2001. (in Chinese)東秀珠, 蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊. 北京: 科學(xué)出版社, 2001.

[3] Cai WC. Practical clinical microbiology diagnostics. Nanjing: Southeast University Press, 1998:1032-1035. (in Chinese)蔡文城. 實(shí)用臨床微生物診斷學(xué). 南京: 東南大學(xué)出版社, 1998: 1032-1035.

[4] Huang YT, Cui J. A simplified gram stain and it’s quality control. Acta Microbiol Sinica, 1996, 36(1):76-79. (in Chinese)黃元桐, 崔杰. 革蘭氏染色三步法與質(zhì)量控制. 微生物學(xué)報(bào), 1996, 36(1):76-79.

[5] Ding HH. Gram stain of vaginal secretions in the two-step in the clinical application of smear. Lab Med, 2009, 24(10):755-756. (in Chinese)丁紅輝. 革蘭染色二步法在陰道分泌物涂片中的臨床應(yīng)用. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué), 2009, 24(10):755-756.

[6] Liu TZ. Bacteria, Gram stain modified two-step staining with the classic four-step clinical evaluation. Int Med Health Guidance News, 2010, 16(4):480-482. (in Chinese)劉婷芝. 細(xì)菌革蘭氏染色改良兩步法與經(jīng)典四步法染色結(jié)果的臨床評價(jià). 國際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào), 2010, 16(4):480-482.

[7] Fischer R, Larose P. Mechanism of gram stain reversaL. J Bacteriol, 1952, 64(4):435-441.

[8] Bartholomew JW, Cromwell T, Gan R. Analysis of the mechanism of gram differentiation by use of a filter-paper chromatographic technique. J Bacteriol, 1965, 90(3):766-777.

[9] Yu YY, Zhao H. Guide to clinical bacteriology laboratory. 2nd ed. Beijing: People's Medical Publishing House, 2006. (in Chinese)于巖巖, 趙鴻. 臨床細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室操作指南. 2版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2006.

[10] Ministry of Health of the People's Republic of China, Medical Administration. National Clinical Laboratory Procedures. 3rd ed. Nanjing: Southeast University Press, 2006:441. (in Chinese)中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司. 全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程. 3版. 南京: 東南大學(xué)出版社, 2006:441.

[11] Ni YX, Wang JL, Xu YC, et al. Antimicrobial susceptibility testing -good laboratory practices. 2nd ed. Shanghai: Shanghai scientific ＆ Technical Publishers, 2009:4-13. (in Chinese)倪語星, 王金良, 徐英春, 等. 抗微生物藥物敏感性-試驗(yàn)規(guī)范. 2 版. 上海: 上海科學(xué)技術(shù)出版社, 2009:4-13.

[12] Shao SH. Pathogen biology diagnostic techniques. Beijing: People's Medical Publishing House, 2009:12-13. (in Chinese)邵世和. 病原生物學(xué)診斷技術(shù). 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2009: 12-13.

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.06.006

200065 上海，同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院性病實(shí)驗(yàn)室，Email：yeying784@sohu.com

2011-11-14