田 力,曹悅鞍

迄今為止,大腸癌的發(fā)生和發(fā)展的確切機(jī)制尚未闡明,但一般認(rèn)為是一個(gè)涉及多因素、多步驟、多基因改變的復(fù)雜過程,包括癌基因的激活、抑癌基因的失活,以及微衛(wèi)星不穩(wěn)定等。以往的研究認(rèn)為腫瘤的分期是影響腫瘤發(fā)展和預(yù)后的唯一因素。自1993年發(fā)現(xiàn)錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷與大腸癌的發(fā)病相關(guān)以來[1-2],越來越多的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)錯(cuò)配修復(fù)基因的失活在大腸癌的發(fā)生及預(yù)后中起著重要的作用。本文歸納了近年來對錯(cuò)配修復(fù)基因的相關(guān)研究,闡述其在大腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制,并探討其臨床預(yù)后、預(yù)測的意義。

1 錯(cuò)配修復(fù)基因系統(tǒng)的分子基

微衛(wèi)星是分布生物基因種系中串聯(lián)的重復(fù)系列,包含單核苷酸、雙核苷酸或多核苷酸重復(fù)序列,如(A)n或(CA)n。這些重復(fù)序列突變易積累,主要是因?yàn)镈NA聚合酶在DNA合成過程中不能將DNA雙鏈有效正確配對起來。微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability,MSI)最常見的錯(cuò)誤是堿基錯(cuò)誤配對,逃脫了DNA聚合酶、插入-缺失回路的本身固有的校對功能。腫瘤的MSI是指與正常細(xì)胞相比,腫瘤細(xì)胞中某一微衛(wèi)星長度發(fā)生改變,也稱“復(fù)制錯(cuò)誤”表型或“普遍性體細(xì)胞突變”。所謂“普遍性體細(xì)胞突變”是指在人體細(xì)胞基因組中普遍存在的被稱為微衛(wèi)星的簡單重復(fù)序列拷貝數(shù)的改變。MSI分為3類,①高頻MSI(MSI-H):2個(gè)或多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)不穩(wěn)定(或檢測的大板標(biāo)記中大于30%的位點(diǎn)不穩(wěn)定);②低頻MSI:只有1個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)不穩(wěn)定(10%～30%標(biāo)記位點(diǎn)不穩(wěn)定);③微衛(wèi)星穩(wěn)定(microsatellite stability,MSS):也稱為無不穩(wěn)定微衛(wèi)星位點(diǎn)(小于10%標(biāo)記點(diǎn)不穩(wěn)定)。MSI的發(fā)生與錯(cuò)配修復(fù)基因系統(tǒng)缺失密切相關(guān)。MSI-H通常稱為DMMR,MSI、MSS稱為PMMR。

錯(cuò)配修復(fù)基因系統(tǒng)(mismatch repaire,MMR)是機(jī)體內(nèi)DNA修復(fù)機(jī)制的一種形式,廣泛存在于生物體內(nèi),在防止基因突變、維持基因組穩(wěn)定性和DNA復(fù)制高保真的過程中起關(guān)鍵作用,具有對微衛(wèi)星監(jiān)測及對其錯(cuò)誤的更正修復(fù)功能。人類錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)是人體細(xì)胞中存在的一種能修復(fù)DNA堿基錯(cuò)配的安全保障系統(tǒng),它由一系列能特異性識別、雙向切除并修復(fù)錯(cuò)配堿基的酶分子組成,對保持遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性和完整性、避免遺傳突變的產(chǎn)生具有重要作用。MMR系統(tǒng)主要包含以下幾種蛋白:MLH 1、MSH2 、MSH 3、MSH6 和 PMS2,它們之間相互連接形成異源二聚體。MSH 2分別與MSH6、MSH 3配對形成 MutSα復(fù)合物和 MutSβ。MutSα可識別單個(gè)堿基錯(cuò)配,MutSβ可識別2～4個(gè)堿基甚至更多的插入或缺失錯(cuò)配[3]。MLH 1則分別與 PMS2、PMS1和 MLH3 形成 MutLα、MutLβ 和MutLγ復(fù)合物。這些蛋白復(fù)合物一旦檢測到堿基錯(cuò)配,就能與有關(guān)的酶配合,切除含有錯(cuò)配的DNA片段,并合成新的DNA片段以代替被切除的部分,進(jìn)而完成錯(cuò)配DNA鏈的修復(fù)過程。MMR缺失會(huì)導(dǎo)致DNA鏈錯(cuò)配的積聚,從而導(dǎo)致MSI。

2 MSI與大腸癌

2.1 MSI引起結(jié)直腸癌的分子機(jī)制 MSI引發(fā)的特殊基因和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑突變,是導(dǎo)致大腸癌的機(jī)制之一。錯(cuò)配修復(fù)基因缺失(deficient mismatch repair,dMMR)引起微衛(wèi)星不穩(wěn)定,微衛(wèi)星重復(fù)序列中30多個(gè)基因突變,如DNA修復(fù)蛋白MRE11A、hRAD50、轉(zhuǎn)化生長 因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)受體 Ⅱ、胰島素樣生長因子(insulin-like grow th factor,IGF)受體Ⅱ、前凋亡因子Bax、錯(cuò)配修復(fù)蛋白MSH3和 MSH6等[4]。這些基因在細(xì)胞功能及轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮多種作用,其突變的急速積聚可誘發(fā)大腸癌的發(fā)生。

BRAF基因突變已被證實(shí)在大腸癌發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用,BRAF15外顯子基因編碼絲氨酸-蘇氨酸激酶,在促分裂原活化蛋白激酶信號通路(RAS/RAF/MEK/MAP)起重要作用,而 RAS/RAF/MEK/MAP激酶途徑在胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中有重要作用,調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。BRAF突變可導(dǎo)致促調(diào)亡蛋白(Bcl-2 interacting mediator of cell death,Bim)的抑制而抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤的發(fā)展[5]。BRAF磷酸化在人類腫瘤中能激活促分裂原活化蛋白(mitogen-activated protein,MAP)/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signalregulating kinase,ERK)1/2,并磷酸化 ERK1/2,激活MAPK(促分裂原活化蛋白激酶),即激活了RAF-促分裂原活化蛋白激酶信號通路(RAF-MEKERK1/2);ERK1/2被激活后,使Bim磷酸化,阻止其綁定到Bcl-2目標(biāo)上,從而抑制細(xì)胞凋亡[6]。

BRAF突變在散發(fā)的hMLH1甲基化的結(jié)直腸癌中普遍存在,已有研究表明BRAF突變與DNA錯(cuò)配修復(fù)缺乏導(dǎo)致的hMLH 1甲基化相關(guān)。例如有實(shí)驗(yàn)證實(shí)87%的有hMLH1甲基化的結(jié)直腸癌細(xì)胞系中存在BRAF突變,而僅4%的hMLH1未甲基化的細(xì)胞系中存在 BRAF突變[7-8]。Domingo等[9]研究顯示,BRAF V600E突變在散發(fā)性MSI-H腫瘤中占40%(82/206),但是在111例遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer,HNPCC)中未檢測出該突變。另一實(shí)驗(yàn)研究顯示,任何 HNPCC患者中均未檢測到 BRAF V600E突變[10]。結(jié)果顯示,BRAF突變經(jīng)常出現(xiàn)在hMLH 1甲基化散發(fā)性結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)患者中,但是不會(huì)出現(xiàn)在HNPCC相關(guān)的腫瘤患者中。這種BRAF突變的差異可能會(huì)用于鑒別散發(fā)的 MSI-H CRC患者和 HNPCC患者。Nagasaka等[7]檢測了11個(gè)位點(diǎn)的啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)與BRAF突變的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)BRAF突變與平均7.2個(gè)(95%,CI:6.6～7.9)位點(diǎn)甲基化相關(guān)。而在散發(fā)性大腸癌中,hMLH1甲基化是導(dǎo)致MSI的主要因素。很多實(shí)驗(yàn)證實(shí),BRAF突變與MSI高度相關(guān)[8,11-12]。有報(bào)道BRAF突變僅在MSI-H腫瘤中存在,而KRAS突變在MSI-L或MSS腫瘤中可被檢測出[13]。故可以推測,散發(fā)性CRC的MSI腫瘤發(fā)展可能經(jīng)由BRAF途徑,但相關(guān)機(jī)制至今沒有被詳細(xì)闡述。

磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI3K)是腫瘤形成的啟動(dòng)子之一,PIK3CA在PI3K通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用,在 30%CRC患者中發(fā)生PIK3C突變[14]。MSI腫瘤PIK3CA突變多于MSS腫瘤[14-15]。MSI腫瘤可能也經(jīng)由PI3K/ATK/mTOR(磷酯酰肌醇3激酶/蛋白激酶/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白)信號通路。

BRAF突變,KRAS突變、CpG島甲基化、PIK3C突變、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性都在結(jié)直腸腫瘤中被高頻檢測到。近年來研究熱點(diǎn)包括四者之間是否存在相關(guān)性,以及它們之間的相互作用、導(dǎo)致結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制。

2.2 遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌與散發(fā)性結(jié)直腸癌MSI的發(fā)生機(jī)制 遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌與散發(fā)性結(jié)直腸癌dMMR發(fā)生機(jī)制不同。MLH 1、MSH 2、MSH 6和 PMS2等基因系突變易導(dǎo)致HNPCC的發(fā)生[16]?；虮硇褪?HNPCC的診斷金標(biāo)準(zhǔn)。79%～93%HNPCC為 MSI表型。MSI作為HNPCC的基因標(biāo)志物作用已在臨床中得到認(rèn)可。由MMR基因變異引起的HNPCC MSI陽性病例隨年齡增長逐漸下降,大于 50歲患者只有17%。MMR基因突變引起男性大腸癌發(fā)生率為60%～70%,女性則為30%～40%[17-18]。HNPCC是常染色體顯性遺傳疾病,占結(jié)直腸癌總發(fā)病率的2%～3%[19]。其特征是發(fā)病年齡輕,多小于50歲,有家族史,以右半結(jié)腸癌為主,常伴有同時(shí)和異時(shí)結(jié)腸原發(fā)癌及結(jié)腸外腫瘤,組織病理學(xué)符合 Lynch syndrome(印戒細(xì)胞、生長緩慢、類克隆病反應(yīng)、黏蛋白含量＞50%、腫瘤淋巴細(xì)胞浸潤)。該類患者預(yù)后較好,5年生存期大于散發(fā)結(jié)直腸癌患者。

在MSI-H散發(fā)性結(jié)直腸癌中,通常發(fā)病年齡超過70歲,主要是MLH 1的CpG島高甲基化表型致d MMR引起,腫瘤抑制基因轉(zhuǎn)錄沉默[8]。MLH 1沉默占MSI-H病例的 95%,MSH 2、MSH6分別占MSI-H的 5%和不足1%[20]。與 MSI-L、MSS相比,MSI-H病例有顯著特點(diǎn),即發(fā)病年齡相對年輕、分化高、發(fā)病部位為近段結(jié)腸、分期早、不易轉(zhuǎn)移,且預(yù)后較好[21]。

3 MSI在結(jié)直腸癌預(yù)后及治療中的作用

一些臨床研究表明,CRC中MSI發(fā)生率波動(dòng)于8%～20%,這與腫瘤分期相關(guān)。Ⅱ期患者M(jìn)SI發(fā)生率最高為20%,Ⅲ期為12%,Ⅳ期發(fā)生率最低為4%[19,22]。其原因還未明確。

MSI表型主要有3個(gè)臨床用途,即:CRC預(yù)后;預(yù)測對化療藥物的反應(yīng),如氟尿嘧啶(5-FU)、伊立替康等;對HNPCC的基因評估。MSI CRC預(yù)后相對MSS更好,不易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。這個(gè)結(jié)論被隨后的臨床研究所證實(shí)[23]。對32個(gè)臨床研究數(shù)據(jù)進(jìn)行meta分析,共包含了7 642例CRC病例,其中1 277病例表型為MSI,分析結(jié)果顯示出MSI腫瘤患者預(yù)后良好優(yōu)勢[22]。提示MSI在CRC中預(yù)后價(jià)值的優(yōu)越性。2009年美國臨床腫瘤學(xué)會(huì)(ASCO)年度會(huì)議上提出MSI在Ⅱ期CRC預(yù)后價(jià)值較Ⅲ期更顯著[24]。

MSI作為5-FU、伊立替康等化療藥物敏感性的預(yù)測分子標(biāo)志物,目前還有爭論[25-26]。Sargent等[27]回顧性研究包含5個(gè)臨床中心的隨機(jī)對照研究5-FU為基礎(chǔ)的輔助化療方案對Ⅱ期、Ⅲ期CRC患者的療效,使用奧沙利鉑、伊立替康、口服氟尿嘧啶等藥物患者被排除在研究范圍外。結(jié)果證實(shí),dMMR在Ⅱ期CRC發(fā)生頻率更高,行5-FU為基礎(chǔ)的化療方案對PMM R和Ⅲ期dMMR CRC患者有效,可提高其無病生存期(isease-free surial,DFs)。但對于dMMRⅡ期CRC患者,化療不僅沒有療效優(yōu)勢,甚至于對MSI CRC患者有危害,可顯著減低其DFA和總生存期。

伊立替康是拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ可引起DNA鏈在復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中出現(xiàn)暫時(shí)缺口。伊立替康可結(jié)合到DNA-拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ復(fù)合物上,阻礙DNA再連接,導(dǎo)致DNA雙鏈分解。如果DNA修復(fù)系統(tǒng)不能發(fā)揮作用,最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。微衛(wèi)星MRE11A、hRAD50突變會(huì)引起DNA修復(fù)功能障礙,理論上可能對伊立替康有效。有4個(gè)臨床研究分析伊立替康對 MSI CRC的治療作用。其中,第1個(gè)研究示單中心72例CRC轉(zhuǎn)移患者按微衛(wèi)星狀態(tài)分類,接受伊立替康治療的臨床試驗(yàn)[28]。第2個(gè)研究是美國腫瘤與血液病學(xué)研究組(GALGB)治療方案前瞻性研究702例Ⅲ期CRC患者,比較5-FU聯(lián)合伊立替康與單藥5-FU輔助化療療效比較[29],數(shù)據(jù)顯示MSI-H聯(lián)合方案治療組有5年無病生存期優(yōu)勢,但無顯著性優(yōu)勢。MSS腫瘤患者未顯示出聯(lián)合化療的優(yōu)勢。在2009 ASCO年會(huì)上提供的研究數(shù)據(jù)未證實(shí)前者結(jié)論。在這個(gè)研究中,回顧性分析了一項(xiàng)隨機(jī)試驗(yàn)PETACC-3試驗(yàn)中1 254例Ⅱ期和Ⅲ期CRC患者,其中188例MSI-H患者伊立替康治療后生存期無改善。Meta分析也未得到Ⅳ期MSI CRC患者接收伊立替康為基礎(chǔ)的化療方案的有效性[28,30]。因此,還需更多的臨床研究來證實(shí)伊立替康對MSI腫瘤的治療作用。

基于上述的研究,2011年結(jié)直腸癌的美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南提出,對小于50歲的CRC患者,應(yīng)該考慮行MMR基因檢測。Ⅱ期MSI-H CRC患者預(yù)后好,但5-FU輔助化療不能使其受益。

許多研究結(jié)果證實(shí),MSI是大腸癌的發(fā)病機(jī)制之一。MSI腫瘤信號通路的研究對其治療策略提供了新思路。例如。微衛(wèi)星MRE11A、hRAD50突變會(huì)引發(fā)DNA雙鏈分解修復(fù)系統(tǒng)缺失,體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)PARP-1抑制劑可抑制MSI細(xì)胞系的生長和MRE11A的表達(dá)水平,有可能成為治療MSI腫瘤的有效靶向劑。由于連接圖譜生物技術(shù)的應(yīng)用,LY-294002和西羅莫司(PI3K/ATK/mTOR信號通路靶向劑)會(huì)引起基因表達(dá)改變,從而抑制MSI腫瘤的表達(dá)[31]。這個(gè)發(fā)現(xiàn)也進(jìn)一步明確了MSI腫瘤的PI3K/ATK/mTOR信號通路,并幫助研發(fā)新的靶向治療劑。

隨著分子生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)的提高,MMR的基因檢測相對簡單、方便,準(zhǔn)確率高。MMR在大腸癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用,是大腸癌預(yù)后及療效預(yù)測的分子標(biāo)志之一。但仍需更多的大宗臨床試驗(yàn)及數(shù)據(jù)來完善MSI在CRC中的作用。尤其在中國,尚未有臨床試驗(yàn)進(jìn)行此研究。不同的MMR基因在不同類型的CRC中發(fā)揮的作用不同,具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究予以闡明,是否存在其他的錯(cuò)配修復(fù)基因及其潛在作用需要進(jìn)一步探索。dMMR的遺傳標(biāo)記的明確和快速準(zhǔn)確的檢測方法也需要進(jìn)一步研究。這些研究的進(jìn)一步深入會(huì)對大腸癌的預(yù)防、早期診斷及治療提供更大的幫助。

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