張志亮，張玉林（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，衛(wèi)輝市 453100；.新鄉(xiāng)醫(yī)學院，新鄉(xiāng)市 453000）

骨舒湯對骨性關節(jié)炎中血清NO和血液流變學的影響

張志亮1＊，張玉林2（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，衛(wèi)輝市 453100；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院，新鄉(xiāng)市 453000）

目的：研究骨舒湯對骨性關節(jié)炎中血清一氧化氮（NO）和血液流變學的影響。方法：隨機選擇健康大耳白兔72只均分成6組，即空白（10m L生理鹽水）、模型（10m L生理鹽水）、壯骨關節(jié)丸（10m L，濃度：0.7 g·m L-1）和骨舒湯高、中、低劑量（20、10、5 m L，濃度：0.7 g·m L-1）組。采用改良的Hulth法復制模型。ig給藥，每天1次，連續(xù)8周。觀察兔血清、軟骨NO含量和血液流變學指標，電鏡下觀察兔膝關節(jié)切片。結(jié)果：模型組兔血清、軟骨NO含量及血液流變學指標顯著高于空白組（P＜0.05）。骨舒湯高劑量組兔血清、軟骨NO含量及血液流變學指標均較模型組顯著下降（P＜0.05）。切片可見，模型組兔骨切片可見壞死軟骨細胞，排列紊亂，潮線不完整；骨舒湯高劑量組兔關節(jié)軟骨面光滑、軟骨細胞柱狀排列，潮線完整。結(jié)論：高劑量骨舒湯可降低模型兔膝骨性關節(jié)炎血清和軟骨中NO含量，同時降低血液流變學指標，調(diào)節(jié)血液功能，從而起到保護關節(jié)軟骨的作用。

骨舒湯；骨性關節(jié)炎；血清一氧化氮；血液流變學

世界衛(wèi)生組織（WHO）流行病學調(diào)查顯示骨性關節(jié)炎是發(fā)達國家最常見的致殘性肌骨骼源性疾病，但骨性關節(jié)炎的發(fā)病機制尚不明確[1]。骨舒湯是當前治療骨性關節(jié)炎的有效經(jīng)驗方，具有良好的效果[2]。本研究設計通過對兔膝骨性關節(jié)炎關節(jié)軟骨中NO含量的測定，研究骨舒湯治療膝骨性關節(jié)炎的療效機制，希望為臨床試驗提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

DK-8A型電熱恒溫水浴箱（上海精宏實驗設備有限公司）；KDC-40型低速離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；723型分光光度機（上海光譜儀器有限公司）；LIANG-100血液比黏度計（香港興萬電子儀器（廈門）有限公司）。

1.2 試藥

熟地、桑寄生、獨活、杜仲、牛膝、當歸、川芎、甘草（河南中信藥材有限公司提供），經(jīng)筆者鑒定為真品；壯骨關節(jié)丸（華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，批號：20100601）；戊巴比妥鈉（河南宏達醫(yī)學儀器有限公司，批號：57-33-0）；大鼠一氧化氮（NO）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 動物

72只實驗標準大耳白兔，體重（2.4±0.062）kg，由新鄉(xiāng)醫(yī)學院實驗動物中心提供（動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（豫）2010-0013）。將兔分籠飼養(yǎng)，自由飲用自來水，溫度、濕度為普通級條件，飼料由實驗動物中心提供。

2 方法

2.1 模型復制

以雙側(cè)卵巢切除法復制骨質(zhì)疏松模型。兔稱重，3%戊巴比妥鈉生理鹽水溶液0.4m L·100 g-1ip行全身麻醉。將兔取仰臥位，固定四肢、頭部于動物手術臺上。取兔下腹部正中，沿腹白線縱向切口2～3 cm，切開皮膚、皮下組織，鈍性分離肌肉，打開腹腔，找到雙側(cè)卵巢并提起后用手術線將其周圍相連血管及輸卵管結(jié)扎，然后切除左右卵巢，用3號手術線縫合切口，75%酒精消毒切口。

2.2 分組和給藥

實驗分為6組，即空白（10m L生理鹽水）、模型（10m L生理鹽水）、壯骨關節(jié)丸（10m L，濃度：0.7 g·m L-1）和骨舒湯高、中、低劑量（20、10、5m L，濃度：0.7 g·m L-1）組。模型復制1周后ig給藥，每天1次，連續(xù)8周。骨舒湯組成：熟地20 g、桑寄生20 g、獨活15 g、杜仲15 g、牛膝15 g、當歸10 g、川芎10 g、甘草5 g，藥材混合后煎煮70m in，取濾液，貯藏，備用。

2.3 NO水平測定

末次ig給藥24 h后，兔耳緣靜脈取血2m L，血液凝固后分離血清，將血清置于－20℃貯藏，待檢。空氣栓塞處死所有兔，迅速切開左后肢關節(jié)，用銳利刀片切取膝關節(jié)前正中的部分滑膜組織，切取股骨內(nèi)髁關節(jié)軟骨及軟骨下骨，10%甲醛溶液固定，標本用0.1moL·L-1二甲砷酸鈉緩沖液漂洗24 h后，用乙二胺四乙酸二鈉溶液脫鈣。脫鈣后用石蠟包埋、切片機連續(xù)橫向切片，厚度61μm，HE染色后光鏡觀察。采用硝酸還原酶法測定NO含量，測定原理根據(jù)NO半衰期短僅數(shù)秒，遇氧或水生成硝酸鹽，硝酸鹽與磺胺及萘乙二胺反應生成粉紅色偶氮化合物，通過比色可間接測定NO含量。同時觀察血液學指標ig給藥后變化：ig給藥后抽取大耳兔腹靜脈血4～5m L，用肝素抗凝搖勻后立即送檢。應用血液比黏度計進行全血比黏度及血漿比黏度測定。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 NO含量的測定

與空白組比較，模型組兔血清及軟骨NO含量顯著增高（P＜0.05）；與模型組比較，骨舒湯高、中、低劑量組兔血清及軟骨NO含量顯著下降（P＜0.05）。血清及關節(jié)軟骨中NO含量測定結(jié)果見表1。

表1 血清及關節(jié)軟骨中NO含量測定結(jié)果（±s）Tab 1 Contentof NO in the serum and cartilage（±s）

表1 血清及關節(jié)軟骨中NO含量測定結(jié)果（±s）Tab 1 Contentof NO in the serum and cartilage（±s）

與空白組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.blank group：＊P＜0.05；vs.modelgroup：#P＜0.05

組別空白組模型組壯骨關節(jié)丸組骨舒湯低劑量組骨舒湯中劑量組骨舒湯高劑量組軟骨32.75±0.41 59.28±0.62＊55.71±0.11 53.87±0.81# 52.47±0.64# 51.23±0.16# n 12 12 12 12 12 12 NO含量/nmol·L-1血清23.42±0.56 39.45±0.20＊36.72±0.20 36.52±0.51# 35.92±0.45# 35.1±0.31#

3.2 切片觀察

骨舒湯高劑量組兔關節(jié)軟骨面較光滑，由淺入深可分為表淺層、移行層、放射層和鈣化層，各層間清晰可辨，軟骨細胞呈柱狀排列，潮線較完整；模型組關節(jié)軟骨表層軟骨變薄、粗糙，部分區(qū)域呈絨毛狀，可見較多裂隙從表層軟骨延伸向下深達輻射層，裂隙中可見稀疏的結(jié)締組織及松散的網(wǎng)狀鏈接，裂隙周圍可見脫水固縮壞死的軟骨細胞，靠近表層有較多囊性改變，整個軟骨細胞排列紊亂，潮線不完整。兔膝關節(jié)切片圖見圖1。

3.3 血液流變學指標

與空白組比較，模型組兔血液流變檢查部分指標（全血黏度高切、全血黏度低切）顯著提高（P＜0.05）；與模型組比較，骨舒湯高劑量組兔血液流變檢查各項指標（全血黏度高切、全血黏度低切、血漿黏度）顯著下降（P＜0.05）。血液流變學指標檢測結(jié)果見表2。

圖1 兔膝關節(jié)切片圖A.骨舒湯高劑量組；B.模型組Fig 1 Slicesof rabbit knee jointA.Gushu decoction high-dosegroup；B.modelgroup

表2 血液流變學指標測定結(jié)果（±s）Tab 2 Determ ination ofhemorheology inde（x±s）

表2 血液流變學指標測定結(jié)果（±s）Tab 2 Determ ination ofhemorheology inde（x±s）

與空白組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.blank group：＊P＜0.05；vs.modelgroup：#P＜0.05

組別空白組模型組壯骨關節(jié)丸組骨舒湯低劑量組骨舒湯中劑量組骨舒湯高劑量組n 12 12 12 12 12 12全血黏度高切/mPa·s-1 4.62±0.63 4.82±0.62＊4.12±0.31 3.50±0.36 3.36±0.56 3.26±0.72#全血黏度低切/mPa·s-1 11.06±1.18 11.39±2.01＊7.78±1.25# 7.90±1.32 7.21±1.23 6.71±1.01#血漿黏度/mPa·s-1 1.99±0.06 2.05±0.04 1.85±0.25 1.81±0.02 1.72±0.03 1.58±0.02#

4 討論

骨性關節(jié)炎的藥物防治目標是借助藥物的抗骨吸收功能以維持骨量和促進骨形成的能力從而提高骨質(zhì)量，達到增強骨強度，超越骨折閾值[3]的目的。NO是一種高度反應性、細胞毒性、彌散性物質(zhì)，對細菌、真菌和腫瘤細胞產(chǎn)生殺傷作用，同時也對正常組織產(chǎn)生損傷[4]。NO主要通過兩種途徑產(chǎn)生組織損傷：（1）高濃度的NO能抑制多種與線粒體電荷傳遞系統(tǒng)及檸檬酸循環(huán)有關的酶，如檸檬酸酶、烏頭酸酶等，通過與酶的硫鐵中心結(jié)合，導致細胞鐵減少而抑制線粒體呼吸，引起細胞損傷。（2）NO在溫度37℃時相當穩(wěn)定，遇到酸性條件便迅速分解為有很強毒性的OH-和N-自由基，這兩種自由基具有非常強的氧化性，因而有很強的細胞毒性，從而造成組織細胞損傷[5]。

有體外試驗發(fā)現(xiàn)，NO在軟骨細胞凋亡中起重要作用，其他細胞調(diào)控因子如白介素（IL）-1、腫瘤壞死因子（TNF）、脂多糖（LPS）、氧自由基等均不能誘導軟骨細胞凋亡。還有研究用橫切斷前交叉韌帶的方法誘導出兔的膝關節(jié)炎模型，發(fā)現(xiàn)脛骨遠端、股骨近端的關節(jié)軟骨能產(chǎn)生較高含量的NO，有軟骨細胞凋亡，且細胞凋亡數(shù)量隨NO含量而變化。有研究證實，人類關節(jié)中的軟骨母細胞在體外培養(yǎng)中并無NO產(chǎn)生，但只要加入炎性細胞因子，如IL-1、TNF-β等，這些炎性因子就會激活軟骨母細胞中的誘導型NOS而產(chǎn)生大量NO。這些炎性細胞因子對軟骨細胞增殖的抑制作用一部分是通過NO實現(xiàn)的[6]。

骨舒湯是前人針對骨性關節(jié)炎“本虛標實"的病因病機而設的經(jīng)驗方，在長期實踐中結(jié)合現(xiàn)代藥理研究運用本方治療骨性關節(jié)炎療效顯著，其治以滋補肝腎、益氣養(yǎng)血，輔以祛風散寒、活血化瘀、通絡止痛的治法。本研究表明，采用骨舒湯治療的模型兔血清及軟骨NO含量顯著低于模型組（P＜0.05）；血液流變檢查各項指標也顯著低于模型組（P＜0.05）。表明骨舒湯具有較好的鎮(zhèn)痛、抗炎、消腫作用，在細胞因子的參與刺激下產(chǎn)生大量NO，調(diào)節(jié)血液功能，維持軟骨的形態(tài)和功能的完整性。

綜上，NO含量升高成為關節(jié)軟骨退變和滑膜炎癥的重要病因之一，骨舒湯能夠有效降低骨質(zhì)疏松模型兔血清、關節(jié)軟骨中NO水平，同時可以引起血液流變學指標的下降，調(diào)節(jié)血液功能，從而對關節(jié)軟骨起到保護作用。

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Effects of Gushu Decoction on Serum NO and Hemorheology of Osteoarthritis

ZHANG Zhi-liang（The FirstAffiliated Hospital of Xinxiang Medical College，Weihui453100，China）
ZHANG Yu-lin（Xinxiang Medical College，Xinxiang 453000，China）

OBJECTIVE：To study the effects of Gushu decoction on serum NO and hemorheology of osteoarthritis.METHODS：72 Japanese white rabbits were random ly divided into 6 groups：blank group（10 m L normal saline），model group（10 m L normal saline），Zhuanggu guanjie pill group（10 m L，0.7 g·m L-1），Gushu decoction high-dose，medium-dose and low-dose groups（20，10，5 m L，0.7 g·m L-1）.Modified Hulth was used to induce osteoarthritismodel.Model rabbits were given relevantmedicines intragastrically once a day for 8 weeks.The contents of NO in serum and cartilage and hemorheology index were observed，and slices of rabbit jointwere observed under electron microscope.RESULTS：The content of NO in serum and cartilage and hemorheology index in model group were significantly higher than blank group（P＜0.05）.The content of NO in serum and cartilage and hemorheology index in Gushu decoction high-dose group decreased significantly，compared w ith model group（P＜0.05）.The patellar slices of rabbits in model group showed cartilage cells necrosis in disorder arrangement，incomplete tidal line.In Gushu decoction high-dose group，smooth cartilage，columnar arrangement of cartilage cell and complete tidal line were observed.CONCLUSION：Gushu decoction high dose can reduce the content of NO in serum and cartilage and hemorheology index，regulate blood function so as to play a protective effect on articular cartilage.

Gushu decoction；Osteoarthritis；Serum NO；Hemorheology

R285；R97

A

1001-0408（2011）31-2892-03

＊主管中藥師。研究方向：藥物臨床應用。E-mail：zyyx2006@ 126.com

2011-01-07

2011-04-09）