蔡麗朋,惠秋沙

(山東中醫(yī)藥大學(xué),山東濟(jì)南 250355)

玉米須 (stigm a m aydis)是禾本科玉蜀黍?qū)僦参镉衩?( Zea m aysL.)的干燥花柱和柱頭,其味甘、淡、性平。玉米須含有多種對人體有益的化學(xué)成分,如多糖、甾醇、黃酮、氨基酸、無機(jī)元素、有機(jī)酸等[1],現(xiàn)代藥理研究證明其中的多糖更是有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、保肝利膽、降血糖、消水腫的作用[2]。將玉米須制成保健飲料不但充分利用了資源,而且具有廣泛的市場。由于玉米須所含多糖的特殊藥理作用,玉米須保健飲料中所含的植物多糖成為實際生產(chǎn)中質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。本實驗采用二硝基水楊酸 (DNS)法測定產(chǎn)品中總多糖的含量,報告如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 U-2800紫外 -可見分光光度計 (日立公司); FA1004型電子分析天平 (上海精密科學(xué)儀器有限公司);電熱恒溫水浴鍋 (上海醫(yī)療器械五廠);DZF-3型真空干燥箱(上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司);DZ4-0.8型低速自動平衡微型離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。

1.2 試藥 葡萄糖 (105℃干燥至恒重);無水乙醇;乙醚;丙酮;氫氧化鈉;DNS(3,5-二硝基水楊酸);酒石酸鉀;無水亞硫酸鈉;蒸餾水,實驗所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的配制 精密稱取在 105℃干燥至恒重的葡萄糖 0.100 3 g,置于 100 mL容量瓶中,加蒸餾水溶解并定容,搖勻,即得 1.003 mg·mL-1葡萄糖對照溶液。

2.1.2 DNS試劑的配制 精密稱取DNS 3.15 g溶于少量水中,加入 2 mol·L-1氫氧化鈉溶液 131 mL,接著邊攪拌邊依次加入 91 g酒石酸鉀、2.5 g苯酚及 2.5 g無水亞硫酸鈉,然后轉(zhuǎn)移至 500 mL容量瓶中,定容,搖勻。后轉(zhuǎn)移至棕色瓶中,放置一個星期后使用。

2.2 實驗條件的確定

2.2.1 測定波長的確定 在“2.2.2.2”正交實驗反應(yīng)結(jié)束測定吸光度之前,掃波長。得DNS法有多個最大吸收波長,尤其在小于 480 nm時有很多最大吸收波長,但雜亂無序,但大于520 nm時,吸收較穩(wěn)定,故其取 520 nm為測定波長(圖 1)。

圖1 波長掃描圖

2.2.2 供試品溶液最佳制備條件確定

2.2.2.1 供試品溶液的制備方法[3]量取樣品玉米須保健飲料 12 mL,置離心管中以 3 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心 10 min,精密量取上清液 10 mL,加入無水乙醇適量,靜置過夜。將上述液體離心,并依次用無水乙醇、丙酮、乙醚多次洗滌沉淀。沉淀減壓真空干燥,配成溶液移入 50 mL量瓶中,加入 6 mol·L-1鹽酸適量,沸水水浴一定時間后迅速冷卻,加 4 mol ·L-1氫氧化鈉溶液適量調(diào) pH=9,定容到 50 mL。

2.2.2.2 正交試驗考察供試品溶液制備的條件 據(jù)文獻(xiàn)報導(dǎo)[4],供試品溶液的制備方法,影響多糖水解成還原糖反應(yīng)程度的因素主要有 6 mol·L-1鹽酸用量、醇沉濃度及樣品水解時間。下面以這三個因素作為考察因素,以吸光度作為考察指標(biāo),各取 3個水平,選用 L9(34)正交表進(jìn)行實驗,以確定最佳條件。因素水平見表 1,試驗安排及結(jié)果見表 2,結(jié)果分析見表3。

根據(jù)表 2制備不同因素不同水平的供試品溶液,精密量取供試品溶液 4 mL共 9份,分至 25 mL容量瓶中,另取水 2 mL置于 25 mL容量瓶中作空白對照,各容量瓶均加入 DNS試劑 1.5 mL,沸水浴 5 min[4,5]。反應(yīng)結(jié)束后,流水冷卻,加水至容量瓶刻度,以空白為參比,于 520 nm處測定吸光度。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 方差分析

從表 2的正交試驗結(jié)果及表 3的方差分析數(shù)據(jù),綜合考慮,A3B3C1為最優(yōu)反應(yīng)條件,即 6 mol·L-1鹽酸 7 mL,85%醇沉,水解時間 10 min為測定多糖的最優(yōu)條件。

2.2.2.3 根據(jù)正交結(jié)果制備供試品溶液 由正交試驗得: 85%醇沉,6 mol·L-1鹽酸 7 mL,水解時間 10 min為最佳條件。故配制樣品溶液時按照此條件,其余操作同“2.2.2.1”項。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取葡萄糖對照品溶液 0.2、0.4,0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL分別置 25 mL容量瓶中且分別補(bǔ)水至 2.0 mL。另取水2.0 mL置于25 mL容量瓶中作空白對照。上述溶液分別精密加入 DNS試液 1.5 mL,于沸水浴中煮沸 5 min,取出立即冷卻,用水稀釋至刻度,搖勻。以空白為參比,于 520 nm波長處測定吸光度。

以吸光度(A)對葡萄糖質(zhì)量濃度(C)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程:A=0.014 1C-0.074 7,r=0.999 4。表明葡萄糖溶液在 8～56μg·mL-1濃度范圍與吸光度呈良好的線性關(guān)系,結(jié)果見表 4,圖 2。

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 精密度及重復(fù)性試驗 精密量取對照品溶液 0.8 mL分置 5支容量瓶中,加水 1.2 mL,按“2.2.2.2”項下“另取水2.0 mL置于 25 mL容量瓶中”起,依法操作,測得吸光度 A分別為 0.381、0.377、0.378、0.383、0.376,算得 RSD = 0.77%,說明方法精密度良好。取同一批的樣品玉米須保健飲料制備供試品溶液 5份,依法測定吸光度,結(jié)果分別為0.306,0.302,0.311,0.308,0.305,求得 RSD =1.1%,說明重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗 取顯色后的供試品溶液,2 h內(nèi)分別于 0、0.5、1.0、1.5、2.0 h測吸光度,結(jié)果分別是 0.309,0.307, 0.309,0.308,0.304,求得 RSD=0.675%,說明實驗方法穩(wěn)定性良好。

2.6 加樣回收率試驗 取同一批玉米須飲料,按供試品溶液制備方法處理的水解液 5份,再分別加入相同量的葡萄糖,各精密量取2 mL,分別加入25 mL容量瓶中,按樣品含量測定的方法測其含量,進(jìn)行回收率實驗[6],結(jié)果見表 5。

表5 回收率實驗結(jié)果

2.7 樣品含量測定 精密量取 4 mL供試品溶液 5份,分別加入 5個 25 mL容量瓶中,其余操作照“2.2.2.2”項下自“另取水 2 mL置于 25 mL容量瓶中”起,測定吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式算出對應(yīng)的濃度C,含量結(jié)果以下公式計算(見表 6):

C樣:樣品保健飲料總多糖含量 (mg·mL-1)

C:吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求出相應(yīng)濃度(μg·mL-1)

V1:樣品保健飲料體積 10 mL

V2:供試品溶液體積 50 mL

V3:測定所取供試品溶液體積 4 mL

V4:顯色后供試品溶液體積 25 mL

表6 樣品含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 DNS比色法的原理是 3,5-二硝基水楊酸與多糖水解產(chǎn)物還原糖共熱后生成棕紅色的氨基化合物(3-氨基 -5-硝基水楊酸)[4],在紫外最大吸收波長處其吸收值與糖濃度呈線性關(guān)系。

3.2 多糖含量測定常用的方法還有苯酚硫酸法[7]和蒽酮硫酸法[8],但這兩種方法都要用到強(qiáng)腐蝕性的濃硫酸,不便操作,再者濃硫酸遇水劇烈放熱使顯色條件難以控制,影響測定結(jié)果;蒽酮硫酸試劑不穩(wěn)定,苯酚溶液易氧化,都得臨用新配。且在測定A值過程中,蒽酮硫酸與苯酚硫酸法的反應(yīng)容量瓶始終置于冰水浴中。DNS法不需要用到濃硫酸,而且DNS法試劑穩(wěn)定,置于常溫下不需冰水,能克服上述兩種方法的缺點。

3.3 此次實驗測定的是玉米須保健飲料中總多糖的含量,并都用了丙酮及乙醚多次洗滌除去脂類以防其對結(jié)果造成影響。另據(jù)文獻(xiàn)報導(dǎo)[3],DNS法可以通過配置不同的供試品溶液而排除單糖的影響,可以看做是 DNS法另一個較大的優(yōu)勢。

[1] 葉盛英,高文遠(yuǎn).中藥玉米須研究進(jìn)展 [J].中成藥, 2008,30(5):745-746.

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