封 麗，張 君，穆 斌，劉 敏

（1.重慶市環(huán)境科學(xué)研究院，重慶401147；2.萬盛區(qū)環(huán)境保護(hù)局，重慶400800；3.重慶市農(nóng)業(yè)機(jī)械鑒定站，重慶402160）

小球藻（Chlorella vulgaris）為綠藻門（Chlorophyta）小球藻屬（Chlorella）普生性單細(xì)胞藻，屬富營(yíng)養(yǎng)型藻類，喜歡有機(jī)質(zhì)豐富的水體［1－3］。斯托姆曾對(duì)藻類的化學(xué)成分進(jìn)行過分析研究，提出藻類的“經(jīng)驗(yàn)分子式”為C106H263O100N16P［4］。根據(jù)李比希最小定律，不難理解藻類的生殖量將主要取決于水環(huán)境中P和N的供應(yīng)量。當(dāng)P或N供應(yīng)充足時(shí)，藻細(xì)胞將充分增殖；如果P或N供應(yīng)量受到限制，那么藻類增殖將受到限制。在藻類種群動(dòng)態(tài)研究中，Monod方程與Droop方程是2個(gè)將營(yíng)養(yǎng)鹽的可利用性與微生物生長(zhǎng)直接聯(lián)系起來的基本動(dòng)力學(xué)方程［5］。一些研究者用Monod方程分析了營(yíng)養(yǎng)鹽濃度對(duì)鼓藻（Cosmarium abbreviatum）、斜生柵藻（Scendesmus obliquus）和銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）等藻類生長(zhǎng)的影響［6－7］。這里則以小球藻為研究對(duì)象，在微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的基礎(chǔ)上研究了N，P對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設(shè)備

生物倒置熒光顯微鏡、分光光度儀、自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器、數(shù)控超聲波清洗器、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、離心機(jī)和血球計(jì)數(shù)板等。試驗(yàn)所需所有玻璃儀器均用超聲波清洗器洗凈，在0.1mg／L稀鹽酸中浸泡30min以上，用新鮮去離子水沖洗干凈，在121℃高壓下蒸汽滅菌，烘干后備用。

1.2 藻種及培養(yǎng)基

小球藻購(gòu)自中科院武漢水生生物研究所（FACHB編號(hào)6）。

BG－11培養(yǎng)基的配制［6］：硝酸鈉1.5g／L，磷酸氫二鉀40mg／L，硫酸鎂75mg／L，氯化鈣36mg／L，檸檬酸6mg／L，檸檬酸鐵銨6mg／L，乙二胺四乙酸1mg／L，碳酸鈉20mg／L，微量金屬離子溶液1mL：硼酸2.86g／L，氯化錳1.81g／L，鉬酸鈉0.39g／L，硫酸銅0.079g／L，硫酸鋅0.222g／L，硝酸鈷0.049 g／L。整個(gè)試驗(yàn)以上述培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，采用新鮮去離子水配制成無磷或無氮培養(yǎng)基，按試驗(yàn)所需質(zhì)量濃度加入相應(yīng)量的P或N。pH值均調(diào)節(jié)到7.4。

1.3 營(yíng)養(yǎng)鹽初始濃度控制

P質(zhì)量濃度分別設(shè)置為0.000，0.002，0.010，0.040，0.200，0.400，0.800，2.000，4.000，8.000，16.000mg／L。

N質(zhì)量濃度分別設(shè)置為0.000，0.050，0.200，0.800，3.200，6.400，12.800，51.200，102.400，153.600，460.800mg／L。

氮磷比（N／P）的濃度設(shè)置：P濃度固定為0.2 mmol／L；比值梯度為0，5，10，30，60，90，150。

以BG－11培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，K2HPO4為磷源，為氮源。控制營(yíng)養(yǎng)鹽初始濃度保持不變，其濃度大到不能成為藻類生長(zhǎng)的限制性元素。

1.4 接種［8］與培養(yǎng)

將購(gòu)買藻種在進(jìn)行試驗(yàn)前先增殖培養(yǎng)1周，再饑餓培養(yǎng)3d。

試驗(yàn)時(shí)，將一定量藻種取出，以5 000r／min的速度離心，保留底液，用15mg／L的碳酸氫鈉溶液洗滌后再次離心，依次重復(fù)3次，最后用無菌水稀釋后用于接種?？刂破鹗荚迕芏仍?.0×104inds／mL左右。

1.5 培養(yǎng)方法

每天不同初始濃度組有3個(gè)重復(fù)樣，光照強(qiáng)度控制住3 000lux左右，溫度25±2℃，光暗比14∶10。每天定時(shí)取樣檢測(cè)藻細(xì)胞密度，相對(duì)于培養(yǎng)液總體積由于取樣量極少（約0.5mL左右），可以近似認(rèn)為符合分批培養(yǎng)試驗(yàn)“試驗(yàn)過程中無底物和菌體的供應(yīng)和移走”的要求；培養(yǎng)方法符合動(dòng)力學(xué)中的“分批培養(yǎng)試驗(yàn)”的要求。試驗(yàn)在無菌操作臺(tái)上進(jìn)行操作。

1.6 細(xì)胞生物量的測(cè)定

藻細(xì)胞生物量的測(cè)定采用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。培養(yǎng)開始后，當(dāng)鏡檢藻細(xì)胞生物量增加小于5%時(shí)，可認(rèn)為藻細(xì)胞增殖達(dá)到最大現(xiàn)存量，結(jié)束實(shí)驗(yàn)。

1.7 增長(zhǎng)率的計(jì)算

增長(zhǎng)率（μ）指在某一時(shí)間間隔內(nèi)藻類生長(zhǎng)的速率，計(jì)算公式：

式中，x2為某一時(shí)間間隔終結(jié)時(shí)的藻類現(xiàn)存量；x1為某一時(shí)間間隔開始時(shí)的藻類現(xiàn)存量，t2－t1為某一時(shí)間間隔。

相對(duì)于藻類初始接種濃度，初始底物濃度較高，因此在培養(yǎng)開始階段可以檢測(cè)到指數(shù)增長(zhǎng)期，但由于底物濃度的不同，指數(shù)生長(zhǎng)速率及指數(shù)生長(zhǎng)期均不相同，根據(jù)底物濃度與生長(zhǎng)速率的關(guān)系可應(yīng)用分批培養(yǎng)試驗(yàn)的動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行分析。

1.8 動(dòng)力學(xué)參數(shù)的計(jì)算

應(yīng)用Leneweaver－Burk作圖法，將Monod方程式μ＝μmaxc／（c＋Ks）變換為以下形式：

式中：μ為微生物的比增殖速度（d－1）；μmax為在飽和濃度中微生物最大比增殖速度（d－1）；c為溶液中限制微生物增殖的底物濃度；Ks為半飽和常數(shù)，其值為μ＝μmax／2時(shí)的底物濃度。以最小二乘法求出上述方程的斜率1／μmax和截距Ks／μmax，斜率的倒數(shù)為1／μmax，其與截距的乘積即為半飽和常數(shù)Ks。

2 結(jié)果與分析

2.1 P對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

P質(zhì)量濃度對(duì)小球藻生長(zhǎng)速率的影響見圖1。

圖1 P質(zhì)量濃度對(duì)小球藻生長(zhǎng)速率的影響

由圖1可以看出，小球藻的生長(zhǎng)率與P質(zhì)量濃度關(guān)系符合公式（2）Monod方程，1／μ＝0.004 2 cP＋2.850（R＝0.989 1）。小球藻在無P的條件下幾乎不生長(zhǎng)；當(dāng)P質(zhì)量濃度在0.002mg／L的極低條件下時(shí)，小球藻細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯的抑制；在濃度為0～0.040mg／L的低P條件下比增長(zhǎng)率明顯增大，其變化區(qū)間為0.191 7～0.321 0d－1；當(dāng)P初始質(zhì)量始濃度高于0.200mg／L時(shí)，小球藻的生長(zhǎng)速率近似維持在同一水平。因此，小球藻細(xì)胞對(duì)P質(zhì)量濃度反應(yīng)很靈敏，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.200mg／L時(shí)出現(xiàn)轉(zhuǎn)折，在高P質(zhì)量濃度0.400～16.000mg／L范圍內(nèi)，比增長(zhǎng)率變化趨勢(shì)減緩。根據(jù)P質(zhì)量濃度與增長(zhǎng)率的回歸方程，計(jì)算得出

2.2 N對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

N濃度對(duì)小球藻增長(zhǎng)率（μ）的影響見圖2。

圖2 N濃度對(duì)小球藻增長(zhǎng)率（μ）的影響

從圖2可以看出，小球藻的生長(zhǎng)率與N質(zhì)量濃度滿足線性關(guān)系，1／μ＝0.515 6 cN＋4.843（R＝0.955 8）。在不同濃度的N培養(yǎng)液中，其質(zhì)量濃度低于0.050mg／L時(shí)，小球藻幾乎不生長(zhǎng)；N質(zhì)量濃度到達(dá)0.800mg／L時(shí)，增長(zhǎng)率出現(xiàn)了明顯的變化。在N質(zhì)量濃度大于102.40mg／L時(shí)，小球藻細(xì)胞數(shù)量仍然繼續(xù)增加，但是增長(zhǎng)速率明顯變緩，N質(zhì)量濃度不再成為小球藻生長(zhǎng)的限制性因子。根據(jù)N質(zhì)量濃度與增長(zhǎng)率的回歸方程，計(jì)算得出

2.3 N／P對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

N／P對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響見圖3。

由圖3可看出，在0～60的范圍內(nèi)，隨著N／P比值的上升，小球藻的增長(zhǎng)率和最大現(xiàn)存量都呈增加趨勢(shì)；在N／P比達(dá)到60的時(shí)候，增長(zhǎng)率和最大現(xiàn)存量達(dá)到最大值；正常BG－11培養(yǎng)基中N／P＝76／1，兩者對(duì)比不難發(fā)現(xiàn)，當(dāng)N／P＝60時(shí)，增長(zhǎng)率和最大現(xiàn)存量都約高于N／P＝76／1時(shí)的值。本實(shí)驗(yàn)說明當(dāng)N／P大于60以后，即使N的濃度繼續(xù)增大，對(duì)小球藻細(xì)胞的增長(zhǎng)也不會(huì)產(chǎn)生影響。

圖3 N／P對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

3 討 論

（1）小球藻細(xì)胞生長(zhǎng)速率對(duì)P質(zhì)量濃度反應(yīng)很靈敏，與0.000mg／L相比，在0.002mg／L的低質(zhì)量濃度下特定增長(zhǎng)率就有提高，P質(zhì)量濃度到0.2mg／L時(shí)，特定增長(zhǎng)率明顯增大；但小球藻在低N質(zhì)量濃度下基本沒有生長(zhǎng)，在0.000～0.050mg／L N質(zhì)量濃度范圍內(nèi)特定增長(zhǎng)率幾乎沒有變化。

（2）根據(jù)回歸分析求得的最大生長(zhǎng)速率μmax為當(dāng)限制性底物濃度趨向無窮大時(shí)生物的生長(zhǎng)速率；半飽和常數(shù)Ks值通常是用來衡量生物物種對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的親和性，Ks值小，表示親和性好，只要很低的營(yíng)養(yǎng)物濃度就使種群增殖率達(dá)到最大生長(zhǎng)率的一半即μmax／2；Ks值大，則親和性差，需要很高的營(yíng)養(yǎng)物濃度才能使種群增殖率達(dá)到μmax／2［9］。小球藻細(xì)胞對(duì)TP的半飽和常數(shù)KSP＝0.0015，對(duì)TN的半飽和常數(shù)KSN＝0.1063，說明CV藻對(duì)P的吸收能力遠(yuǎn)高于對(duì)N的吸收能力。

（3）對(duì)小球藻增長(zhǎng)率來說，其增加速度較快的TP質(zhì)量濃度區(qū)間：0.000～0.200mg／L，TN質(zhì)量濃度區(qū)間：0.050～0.800mg／L；從現(xiàn)存量看，其增加速度較快的TP質(zhì)量濃度區(qū)間：0.040～0.400mg／L，TN質(zhì)量濃度區(qū)間：0.800～6.400mg／L。

（4）經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，水華的發(fā)生首先是水體中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過量，致使水體達(dá)到富營(yíng)養(yǎng)程度增大，這是發(fā)生水華現(xiàn)象的最重要的物質(zhì)基礎(chǔ)［10］。但是并非營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度高就一定發(fā)生水華，其中一個(gè)重要原因是每種能引起水華的藻類都有其特定的合適營(yíng)養(yǎng)鹽濃度范圍［11－13］。N／P往往成為藻類生長(zhǎng)的重要限制因素，當(dāng)小球藻在N／P比值為0～60范圍內(nèi)時(shí)，隨著N／P比值的上升，小球藻的增長(zhǎng)率和最大現(xiàn)存量都呈增加趨勢(shì)；在N／P比達(dá)到60的時(shí)候，增長(zhǎng)率和最大現(xiàn)存量達(dá)到最大值；正常BG－11培養(yǎng)基中N／P＝76／1，兩者對(duì)比不難發(fā)現(xiàn)，當(dāng)N／P＝60時(shí)，增長(zhǎng)率和最大現(xiàn)存量都約高于N／P＝76／1時(shí)的值，本實(shí)驗(yàn)說明當(dāng)N／P大于60以后，即使N的濃度繼續(xù)增大，對(duì)小球藻細(xì)胞的增長(zhǎng)也不會(huì)產(chǎn)生影響。

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