趙金紅,許金鵬,李朝品

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 人體寄生蟲學(xué)教研室,安徽 蕪湖 241002;2.安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科,安徽 合肥230031)

原卟啉鈉(Protoporphyrin disodium,NAPP)是一種卟吩衍生物,化學(xué)名稱為1,3,5,8-四甲基-2,4-二乙烯基卟吩-6,7-二丙酸鈉,由4個(gè)吡咯環(huán)經(jīng)4個(gè)次甲基鍵連接而成的含共軛雙鍵的大環(huán)化合物,可促進(jìn)組織細(xì)胞呼吸,改善蛋白質(zhì)和糖代謝,具有保肝降酶作用,臨床用于治療急、慢性肝炎,并對(duì)肝硬化、膽囊炎及膽石癥有一定療效[1,2]。目前制備原卟啉鈉的工藝普遍存在操作繁雜、中間產(chǎn)物多、周期長(zhǎng)、制備成本高等缺點(diǎn)[3～5]。為克服上述不足,本研究以血紅素為原料,建立并優(yōu)化了原卟啉鈉制備工藝,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 血紅素(本實(shí)驗(yàn)室自制,純度為90.8%),丙酮、鹽酸、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、甲醇、氯仿、甲苯、硫酸亞鐵等(國(guó)產(chǎn)分析純),溴化鉀(國(guó)產(chǎn)光譜純),原卟啉鈉標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司,純度≥98.0%);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠,RE-2000),循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司,SHB-Ⅲ),超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司,JY96-Ⅱ),紫外分光光度計(jì)(蘇州島津,UV-2550)。

1.2 原卟啉鈉的制備工藝 血紅素5.0 g加入甲醇與氯仿的混合液中(甲醇:70 ml,氯仿:120 ml),再加硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)4.5 g,攪拌20 min,通氯化氫氣體60 min(脫鐵)。反應(yīng)液移入三角燒瓶?jī)?nèi),90℃加熱回流2 h(酯化),冷卻后,抽濾,用100 ml氯仿沖洗沉淀,收集濾液,加入等體積雙蒸水,用力振蕩,洗滌濾液,轉(zhuǎn)入分液漏斗內(nèi),靜置分層,分取氯仿層(生成的原卟啉二甲酯溶于其中,呈紫紅色),繼續(xù)加適量雙蒸水洗滌氯仿層至中性,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去氯仿層中的氯仿,原卟啉二甲酯析出,向回收氯仿后的殘留物中加入50 ml甲苯,加熱,待析出的沉淀溶解后,再加入1 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液80 ml,90℃加熱回流2 h(皂化),冷卻后原卟啉鈉生成析出,抽濾,用適量氯仿洗滌2次后干燥,即得原卟啉鈉,稱重,并計(jì)算原卟啉鈉產(chǎn)率。

1.3 原卟啉鈉樣品的定性測(cè)定 紫外-可見(jiàn)吸收光譜法:將原卟啉鈉標(biāo)準(zhǔn)品與提取的原卟啉鈉樣品105℃干燥至恒重,準(zhǔn)確稱量干燥好的原卟啉鈉標(biāo)準(zhǔn)品和樣品,用1%鹽酸甲醇溶液溶解,制成200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液的母液備用。再分別制成2.00 mg/L的稀溶液,用紫外分光光度計(jì)于300～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。

1.4 原卟啉鈉樣品的含量和純度測(cè)定

1.4.1 原卟啉鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以1%鹽酸甲醇溶液為空白,用紫外分光光度計(jì)于最大吸收波長(zhǎng)409 nm處測(cè)定不同濃度的原卟啉鈉標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度。以原卟啉鈉標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程。

1.4.2 原卟啉鈉的精密度和回收率

1.4.2.1 精密度:量取原卟啉鈉標(biāo)準(zhǔn)品母液,制成2.00 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,在409 nm處測(cè)定其吸光度,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)結(jié)果。

1.4.2.2 回收率:量取9份原卟啉鈉樣品母液0.50 ml,分為3組。每組分別加入原卟啉鈉標(biāo)準(zhǔn)品母液0.25 ml、0.50 ml、1.00 ml,用1%鹽酸甲醇溶液定容至100 ml,測(cè)定結(jié)果作為加樣回收試驗(yàn)的測(cè)得回收量。此外,另分別移取原卟啉鈉樣品母液0.50 ml和原卟啉鈉標(biāo)準(zhǔn)品母液0.25 ml、0.50 ml、1.00 ml,用1%鹽酸甲醇溶液定容至100 ml,測(cè)定結(jié)果作為樣品加入量和標(biāo)準(zhǔn)品加入量。在409 nm處分別測(cè)溶液的吸光度,代入回歸方程計(jì)算加樣回收率。

1.4.3 原卟啉鈉樣品的含量和純度測(cè)定 制濃度為2.00 mg/L的原卟啉鈉樣品溶液,以1%鹽酸甲醇溶液為空白,在409 nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度,代入回歸方程,計(jì)算出2.00 mg/L的原卟啉鈉樣品溶液中原卟啉鈉含量,并利用純度計(jì)算公式計(jì)算提取的原卟啉鈉樣品的純度。

1.5 單因素試驗(yàn)對(duì)原卟啉鈉制備工藝的優(yōu)化 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和影響酯化、皂化反應(yīng)的因素、條件等,本研究選擇酯化時(shí)甲醇用量、皂化時(shí)的1 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液用量、加熱回流溫度、加熱回流時(shí)間4個(gè)主要因素,采用單因素方法,以血紅素為原料,對(duì)NAPP的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。

每次以5.0 g血紅素為原料,按上述制備工藝制備原卟啉鈉,比較酯化時(shí)不同甲醇用量(50 ml、60 ml、70 ml、80 ml)、皂化時(shí)不同1 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液用量(60 ml、70 ml、80 ml、90 ml)、不同加熱回流溫度(70℃、80℃、90℃、100℃)、不同加熱回流時(shí)間(1 h、1.5 h、2 h、2.5 h)對(duì)原卟啉鈉產(chǎn)率的影響,以確定最佳的制備條件和參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 原卟啉鈉樣品的一般性質(zhì)和產(chǎn)量 制備的原卟啉鈉為紫褐色結(jié)晶,易溶于水和酸性甲醇溶液,微溶于稀鹽酸溶液,不溶于氯仿,105℃不熔解。該法制備原卟啉鈉的平均產(chǎn)量為3.46 g/5 g血紅素,平均產(chǎn)率為69.2%。

2.2 原卟啉鈉樣品的定性結(jié)果 紫外-可見(jiàn)吸收光譜法結(jié)果顯示,于300～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi),原卟啉鈉樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的光譜圖基本一致,分別在409 nm、556 nm、600 nm波長(zhǎng)處顯示吸收峰,最大吸收峰在409 nm處(圖1)。

圖1 原卟啉鈉樣品與原卟啉鈉標(biāo)準(zhǔn)品的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖1.原卟啉鈉標(biāo)準(zhǔn)品;2.原卟啉鈉樣品Fig 1 Ultraviolet-visible absorption spectrum of NAPP sample and standard substance1.NAPP standard substance;2.NAPP sample

2.3 原卟啉鈉樣品的含量和純度 原卟啉鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為у=0.3801x+0.0029(R2=0.9997),相關(guān)系數(shù)趨近于1,該回歸方程可用于計(jì)算原卟啉鈉樣品中原卟啉鈉的含量。平均吸光度值為0.7545,RSD=0.32%(n=6),平均回收率為99.49%,RSD=1.99%(n=9),表明該法測(cè)定原卟啉鈉的精密度、回收率良好。

經(jīng)計(jì)算,原卟啉鈉樣品溶液中原卟啉鈉含量為1.74 mg/L,純度為88.8%。

2.4 原卟啉鈉制備工藝優(yōu)化的結(jié)果

2.4.1 最佳甲醇用量 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,甲醇用量為50 ml時(shí),原卟啉鈉產(chǎn)率僅23.5%,隨著甲醇用量的增加,原卟啉鈉產(chǎn)率增高,當(dāng)甲醇用量達(dá)到70 ml時(shí),原卟啉鈉產(chǎn)率達(dá)68.7%,但當(dāng)用量為80 ml時(shí),產(chǎn)率幾乎不再增高(圖2),結(jié)合成本等因素,故確定最佳甲醇用量為70 ml。

2.4.2 最佳1 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液用量 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,1 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液用量為60 ml時(shí),原卟啉鈉產(chǎn)率為45.3%,隨著加入量的增加,原卟啉鈉產(chǎn)率相應(yīng)增高,當(dāng)1 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液用量達(dá)到80 ml時(shí),原卟啉鈉產(chǎn)率達(dá)67.5%,但當(dāng)加入90 ml時(shí),產(chǎn)率為68.2%,增高不明顯(圖3),鑒于成本考慮,確定最佳的1 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液用量為80 ml。

圖3 不同1 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液用量對(duì)原卟啉鈉產(chǎn)率的影響Fig 3 Effect of different concentration of 1 mol/L sodium hydroxide-methanol solution on yield of NAPP

2.4.3 最佳加熱回流溫度 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,加熱回流溫度為70℃時(shí),原卟啉鈉產(chǎn)率僅為31.5%,隨著溫度的升高,原卟啉鈉產(chǎn)率隨之增高,加熱回流溫度為90℃時(shí)原卟啉鈉產(chǎn)率增至69.1%,但當(dāng)加熱回流溫度升至100℃時(shí),原卟啉鈉產(chǎn)率反而下降至60.8%(圖4),故確定最佳加熱回流溫度為90℃。

2.4.4 最佳加熱回流時(shí)間 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,加熱回流1 h時(shí)原卟啉鈉產(chǎn)率僅43.8%,隨著加熱回流時(shí)間延長(zhǎng),原卟啉鈉產(chǎn)率迅速增高,當(dāng)加熱回流2 h時(shí)其產(chǎn)率迅速增加至65.5%,但加熱回流時(shí)間延長(zhǎng)至2.5 h時(shí)原卟啉鈉產(chǎn)率僅增加1.6%(圖5),鑒于成本和生產(chǎn)周期等因素考慮,因而確定最佳加熱回流時(shí)間為2 h。

圖4 不同加熱回流溫度對(duì)原卟啉鈉產(chǎn)率的影響Fig 4 Impact of different heating and distilling temperature on yield of NAPP

圖5 不同加熱回流時(shí)間對(duì)原卟啉鈉產(chǎn)率的影響Fig 5 Impact of different heating and distilling time on yield of NAPP

3 討論

原卟啉鈉在體內(nèi)外具有一定的抗炎和抗變態(tài)反應(yīng)作用,亦有報(bào)道NAPP對(duì)肝癌、胃癌、食道癌、肺癌等有抑制癌性疼痛、預(yù)防轉(zhuǎn)移、增加食欲的作用[6,7]。目前報(bào)道的以血紅素為原料制備原卟啉鈉的方法大多需經(jīng)過(guò)粗原卟啉、原卟啉二甲酯、原卟啉純品等中間制備過(guò)程才能制得原卟啉鈉。存在的缺點(diǎn)是中間產(chǎn)物多、操作繁雜、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、需要柱層析分離純化及制備成本高等[3～5]。本研究中原卟啉鈉的制備是以本實(shí)驗(yàn)室自制的血紅素為原料,經(jīng)硫酸亞鐵-氯化氫氣體-甲醇-氯仿脫鐵酯化成原卟啉二甲酯,原卟啉二甲酯無(wú)需分離,直接經(jīng)氫氧化鈉甲醇溶液皂化制得原卟啉鈉。這樣既減少了中間產(chǎn)物,簡(jiǎn)化了操作步驟,又革除了柱層析,制備周期大大縮短,所用氯仿又可經(jīng)蒸餾回收而重復(fù)利用,既降低了制備成本,又減少了其對(duì)環(huán)境的污染。

本研究根據(jù)酯化與皂化反應(yīng)的條件和特點(diǎn)及預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果選擇了酯化時(shí)的甲醇用量、皂化時(shí)的1 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液用量、加熱回流溫度、加熱回流時(shí)間4個(gè)因素,分別研究了其對(duì)原卟啉產(chǎn)率的影響。結(jié)果顯示,甲醇用量達(dá)70 ml時(shí),酯化反應(yīng)速率已達(dá)到最高,即使增加甲醇用量也不能促進(jìn)酯化反應(yīng)進(jìn)行;隨著氫氧化鈉甲醇溶液量的增加,促進(jìn)皂化反應(yīng)的進(jìn)行,原卟啉鈉產(chǎn)率隨之增高,當(dāng)用量達(dá)80 ml時(shí),反應(yīng)速率已達(dá)到最高,即使再增加氫氧化鈉甲醇溶液量也不能促進(jìn)皂化反應(yīng)進(jìn)行;溫度升高可以促進(jìn)酯化和皂化反應(yīng)進(jìn)行而使原卟啉鈉生成增加,但酯化和皂化反應(yīng)是可逆反應(yīng),當(dāng)加熱回流溫度升至100℃時(shí),原卟啉鈉產(chǎn)率反而下降至60.8%,可能由于酯化和皂化反應(yīng)的逆反應(yīng)速率更快而使原卟啉鈉生成減少,產(chǎn)率下降。故確定最佳甲醇用量為70 ml,最佳1 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液用量為80 ml,最佳加熱回流溫度為90℃,最佳加熱回流時(shí)間為2 h。

本研究建立了原卟啉鈉的制備工藝,并確定了最佳制備條件,這為原卟啉鈉的生物活性研究奠定了基礎(chǔ)。

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