張新高 王立欣 侯 杰

（1.廣東省深圳市南山區(qū)動物防疫監(jiān)督所，深圳 518051；

2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642）

北京犬ITS-2 rDNA的PCR擴增、克隆及分析

張新高1王立欣2侯 杰2

（1.廣東省深圳市南山區(qū)動物防疫監(jiān)督所，深圳 518051；

2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642）

本研究以從中國廣東深圳某動物醫(yī)院采集的北京犬血液樣品為研究對象，經(jīng)反復(fù)摸索，選用LA Taq 酶結(jié)合降落PCR方法，成功地擴增出北京犬的核糖體基因組（rDNA）的第2內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS-2）序列。將PCR擴增出的片段純化后克隆至pGEM-T Easy載體，用PCR技術(shù)及酶切鑒定陽性菌落，對陽性菌落質(zhì)粒DNA進行測序。結(jié)果表明，ITS-2片段大小為1 138bp，GC含量為83.57%。本研究為犬線粒體等真核生物高GC含量序列的有效擴增作了有益的探索。

北京犬 ITS-2 高GC含量 PCR 克隆

人和犬（Canis familliaris）的密切聯(lián)系已有很長的歷史，犬的飼養(yǎng)至少已有14 000年歷史，其祖先是灰狼（Canis lupus），犬在世界的普遍飼養(yǎng)，顯示其一直以來在人們的生活中起到重要作用[1-2]。在幾萬年之前，波斯人和希臘人就開始飼養(yǎng)犬這種家畜。在中國西安半坡遺址和常州圩墩遺址中發(fā)現(xiàn)了犬的骨骼，推斷我國養(yǎng)犬的歷史也有約5 000～6 000年之久[3]。近年來，隨著國內(nèi)經(jīng)濟的迅速發(fā)展，人們生活水平得到提高，寵物犬飼養(yǎng)量不斷增多。對于現(xiàn)代犬種的種群關(guān)系以及形態(tài)多樣的品種之間的親緣關(guān)系，眾多研究者一直有很大的興趣，對于犬品種的多樣化的起源以及品種的關(guān)系在考古學(xué)以及生物學(xué)等多方面進行探討，但仍然存在很多爭議。

隨著科技的不斷進步，分子遺傳學(xué)分析為犬的遺傳變異及種群遺傳學(xué)研究等提供了新的手段，從基因水平上反映犬種的遺傳信息可以明確犬種的遺傳變異水平以及種群分析。研究表明，rDNA的ITS-2序列在生物化過程中顯示種的特征，種內(nèi)具有高度保守性，在不同種間又有不同程度的變異，是理想的種間鑒定的遺傳標記[4-7]。本試驗以從中國廣東深圳某動物醫(yī)院采集的北京犬為研究對象，對其核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS序列進行PCR擴增、測序，為犬品種的分子鑒定和分子遺傳學(xué)研究提供了科學(xué)根據(jù)，也為擴增高GC含量序列的同類研究提供借鑒、例證。

1 材料和方法

1.1 犬血樣

犬血樣采自中國廣東深圳某動物醫(yī)院，犬的品種為北京犬，樣品編號為L4，2 ml全血加0.3 ml 0.5%的EDTA，血樣置于-20℃保存。

圖1 北京犬核糖體ITS-2序列PCR產(chǎn)物電泳圖

1.2 主要試劑

LA Taq酶，GC buffer Ⅱ，DL-2000 DNA Marker均為TaKaRa產(chǎn)品；pGEM-T Easy載體試劑盒、感受態(tài)細胞JM109為Promega產(chǎn)品；DNA膠回收試劑盒為上海生工產(chǎn)品。

1.3 DNA提取

取-20 ℃冷凍保存的外周抗凝血，用2 ml離心管裝500 μl血樣，置于冷凍離心機內(nèi)，在4℃，3 000轉(zhuǎn)/分的條件下離心20 min，去除血漿，以酚-氯仿法提取總DNA。

1.4 PCR擴增

本試驗中擴增（L4）犬線粒體ITS-2序列的引物為：C5.8SF：5’- CGA AAG CAC TTG TGG CCC TGG GTT CCT C-3’；CITSR：5’-CCG TTT ACC TCT TAA TGG TTT CAC GCC CTC-3’，由上海英峻生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴增體系為25μl，各組分如下：2×GC buffer Ⅱ 12.5 μl，2.5 mM each dNTPs 4 μl，50 μM 的上下游引物各0.25 μl，LA Taq酶0.25 μl，模板DNA 1 μl，滅菌雙蒸水6.75 μl。PCR反應(yīng)條件為：先94 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性30 sec，68 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，5個循環(huán)，后94 ℃變性30 s，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。同時設(shè)不加DNA模板的陰性對照。擴增產(chǎn)物經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳，于紫外透射儀上觀察并記錄結(jié)果。

1.5 擴增片段的克隆及篩選

以DNA膠回收試劑盒對所擴增片段進行純化，純化產(chǎn)物連接到pGEM-T Easy載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞JM109中，在含氨芐青霉素和IPTG的LB平板上無菌挑選白色的單菌落，對菌落進行PCR鑒定和酶切鑒定，篩選獲得陽性克隆。

圖2 北京犬ITS-2片段的菌液PCR鑒定圖

圖3 北京犬ITS-2片段重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖

1.6 測序

將鑒定為陽性的重組菌送上海英峻生物技術(shù)有限公司進行雙向測序，然后進行序列分析。

2 結(jié)果

2.1 ITS及5.8S序列的PCR擴增

以提取的北就犬的基因組為模板，以C5.8S和CITSR作為引物進行PCR擴增，同時設(shè)不加DNA模板的陰性對照。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠進行電泳，可見約1 500 bp的條帶（圖1），與預(yù)期目的片段大小一致。

2.2 ITS-2片段的克隆、PCR和酶切鑒定

用純化回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物并將之克隆到pGEM-T Easy載體中，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞JM109，后進行PCR鑒定。結(jié)果，8個單菌落均為陽性（見圖2），對PCR鑒定為陽性的3個單菌落進行質(zhì)粒小量抽提，所得重組菌分別標為：pGEM-O1和pGEM-O2和pGEM-O3；經(jīng)EcoRⅠ酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)兩條帶，小片段約為1 500 bp，為插入的片段，大片段為質(zhì)粒載體（見圖3）。

2.3 測序

測序結(jié)果表明，北京犬ITS-2片段大小為1138時間bp，GC含量高達83.57%，序列如下：

3 討論

核糖體DNA（rDNA）是由一些高度重復(fù)序列組成的多基因家族。rDNA基因的高度保守性使其突變累積在成串重復(fù)排列的rDNA之間和兩側(cè)的間隔區(qū)序列中，而使核糖體基因間隔區(qū)序列具有種內(nèi)和種間、以及亞種和株的特異性，從而用于分類學(xué)和種株鑒定。ITS是rDNA中介于18S和28S之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，包括ITS-1和ITS-2兩段序列。研究表明，rDNA的ITS-1及ITS-2序列在生物進化過程中顯示種的特征，種內(nèi)具有高度保守性，在不同種間又有不同程度的變異，是理想的種間鑒定的遺傳標記，應(yīng)用于多種生物的分子鑒定和分子遺傳學(xué)研究[8]雖然rDNA序列對進化關(guān)系的確定、個體差異的檢測以及構(gòu)建遺傳圖譜有重要價值，但由于真核生物基因組的rDNA具有較高的GC含量，而且是結(jié)構(gòu)復(fù)雜的重復(fù)序列，采用通常的PCR擴增難以成功，特別是高GC含量的大片段尤其困難，因此在PCR的反應(yīng)條件上，有人采用退火溫度較高的一般PCR反應(yīng)條件，也有采取用熱啟動PCR方法的，還有采用降落PCR（TDPCR）反應(yīng)條件的，取得一定的效果[9-13]。標準的TD-PCR一般需設(shè)置多個退火溫度，程序比較復(fù)雜，而且特異性產(chǎn)物量較少。本研究經(jīng)反復(fù)摸索，選用LA Taq 酶結(jié)合降落PCR方法，成功地擴增出北京犬（L4）的核糖體基因組的ITS-2序列，將PCR擴增出的片段純化后克隆至pGEM-T Easy載體，用PCR技術(shù)及酶切鑒定陽性菌落，對陽性菌落質(zhì)粒DNA進行測序。結(jié)果表明，ITS-2片段大小為1138bp，GC含量高達83.57%。本研究的降落PCR只設(shè)置2個退火溫度，程序簡單，特異性產(chǎn)物多，獲得良好的反應(yīng)效果，為犬種的遺傳變異水平以及種群分析等進一步研究奠定了基礎(chǔ)，也為高GC含量序列的有效擴增作了有益的探索。

圖4 北京犬rDNA ITS-2 序列

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