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酶標(biāo)法檢測(cè)CA242不確定度的評(píng)估分析

2011-01-29 15:13周艷秋高紅軍王洪武
關(guān)鍵詞:酶標(biāo)儀高值標(biāo)本

周艷秋,高紅軍,田 穎,王洪武

煤炭總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,北京 100028

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)可以定性或定量分析樣品中目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況,但結(jié)果的重復(fù)性和可靠性較難控制。測(cè)量不確定度(uncertainty in measurement,UM)是醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系及檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化工作的重要組成部分[1]。CA242是消化道腫瘤常用的檢測(cè)指標(biāo),目前臨床檢測(cè)CA242以定量酶標(biāo)法為主,各醫(yī)院對(duì)該項(xiàng)目的檢測(cè)報(bào)告未采用UM的形式。為更客觀反映該項(xiàng)目的檢測(cè)結(jié)果,對(duì)我室ELISA法檢測(cè)CA242的UM進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

三份新鮮血液均為我院住院患者靜脈血,2 000 r/min離心10 min,分離血清,分裝后凍存于-80℃冰箱內(nèi)。不同樣本中CA242的含量均在試劑檢測(cè)的線性范圍內(nèi)。

1.2 儀器與試劑

瑞典康乃格診斷試劑公司CA242診斷試劑盒(批號(hào):28559∶1);德國(guó)Sigma公司大容量冷凍離心機(jī)4-16k型;芬蘭BIOHIT 微量加樣器(100~1 000 μl量程及 10~100 μl量程各1支);美國(guó)Awareness公司酶標(biāo)儀STAT FAX2100;中國(guó)杭州奧盛儀器有限公司MB100-4P型微孔板恒溫振蕩器。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 檢測(cè)步驟 依照商品化試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和1個(gè)低值質(zhì)控,各設(shè)置5個(gè)平行孔;低、中、高值待測(cè)樣品各重復(fù)5次。酶標(biāo)儀405 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度值(OD值)。

1.3.2 建立檢測(cè)模型 樣本濃度計(jì)算公式:y=f(x)×fV×fA×frep

fV、fA、frep分別表示加樣體積、吸光度值和檢測(cè)精密度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響,f(x)表示樣品吸光度值x與濃度y之間的轉(zhuǎn)換公式。 fV=fA=frep=1,故 y=f(x)。

1.3.3 UM的分類與來(lái)源 根據(jù)文獻(xiàn)[1-2]進(jìn)行A類UM和B類UM進(jìn)行的評(píng)定。

2 結(jié)果

2.1 A類UM的評(píng)定

2.1.1 重復(fù)比色引入的u(A1)三種濃度標(biāo)本和質(zhì)控樣品分別固定一孔重復(fù)讀數(shù)5次后觀察OD值的變化,計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)差,根據(jù)CNAS-GL05:2006測(cè)量不確定度要求的實(shí)施指南[3],結(jié)果見(jiàn)表 1。

2.1.2 重復(fù)樣本引入的u(A2)三種濃度標(biāo)本和質(zhì)控樣品重復(fù)孔檢測(cè)引入的UM,結(jié)果見(jiàn)表1。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn) UM 的合成 由于 u(A1)和 u(A2)之間相互獨(dú)立,因此標(biāo)準(zhǔn)UMu(frep)等于二者平方和的平方根。

表1 CA 242 A類UM的評(píng)定結(jié)果

2.2 B類UM的評(píng)定

2.2.1 OD值與濃度轉(zhuǎn)換引入的uf(x)根據(jù)試劑使用說(shuō)明運(yùn)用上海思橋檢驗(yàn)軟件中的QUANRATIC-ICON方程擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=13.58x2+60.127x-0.252 7(r2>0.999),其中 x 為標(biāo)準(zhǔn)品或樣本OD值,y為標(biāo)準(zhǔn)品或樣本中CA 242的濃度。以x+s為上限,x-s為下限作圖,獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線的可接受范圍,參照文獻(xiàn)[4],計(jì)算標(biāo)準(zhǔn) UM,結(jié)果見(jiàn)表 2,Ymax、Y、Ymin分別表示樣本的平均吸光度值在曲線上限、標(biāo)準(zhǔn)曲線和曲線下限時(shí)的樣本濃度值。

表2 擬合曲線引入的UM計(jì)算結(jié)果

2.2.2 移液器加樣引入的u(fV) 根據(jù)文獻(xiàn)[1-2]移液器加樣引入的 UM,u(fV)=0.080 225 μl。

2.2.3 酶標(biāo)儀測(cè)定引入的UM u(fA)根據(jù)文獻(xiàn)[2]酶標(biāo)儀在不同讀數(shù)范圍內(nèi)的 UM 分別為:u(fA)=0.005 77(0.1~1.5 A);u(fA)=0.011 5(1.5~3.0 A)。

2.3 合成的總 UM uc(y)

根據(jù)文獻(xiàn)[2]計(jì)算試驗(yàn)結(jié)果總的UM uc(y)見(jiàn)表3。依據(jù)CNAS-GL06:2006《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[5],以條形圖展示了不同測(cè)定樣本中UM分量的大小,見(jiàn)圖1。

表3 樣本檢測(cè)UM的結(jié)果

2.4 擴(kuò)展UM

取置信水平P=95%,包含因子K=2.1,不同濃度樣本的擴(kuò)展 UM 為 U(y)=uc(y)×2.1,見(jiàn)表 3。

2.5 結(jié)果報(bào)告

待檢測(cè)樣品的檢測(cè)結(jié)果:低值標(biāo)本=4.482±0.872,中值標(biāo)本=41.892±8.066,高值標(biāo)本=102.355±19.732。

3 討論

CA242是一種唾液酸化的黏蛋白型糖類抗原,是與胰腺癌、膽囊癌和結(jié)腸癌等相關(guān)的腫瘤標(biāo)記物[6-7]。臨床上常用的檢測(cè)方法是用酶標(biāo)儀進(jìn)行比色分析,上機(jī)檢測(cè)前主要依靠手工操作,影響檢測(cè)結(jié)果可靠性的因素較多,本研究通過(guò)UM的評(píng)定方法試圖發(fā)現(xiàn)酶標(biāo)法檢測(cè)CA242的主要影響因素。

UM是表征被測(cè)量值所處量值范圍內(nèi)的參數(shù),是衡量檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性的重要參數(shù)。只有充分運(yùn)用UM的評(píng)估來(lái)識(shí)別試驗(yàn)中各種因素對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響,才能對(duì)檢測(cè)設(shè)備、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、檢測(cè)方法、環(huán)境條件、被檢測(cè)物質(zhì)的性能和狀態(tài)以及操作者的技能進(jìn)行比較全面的分析,從而有效控制各個(gè)環(huán)節(jié),保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。本試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)血清CA242的含量,評(píng)估酶標(biāo)法檢測(cè)CA242的UM,明確影響該檢測(cè)結(jié)果的主要因素。

定量ELISA法檢測(cè)生物標(biāo)志物所涉及的影響因素較多,如酶標(biāo)儀、試劑質(zhì)量、環(huán)境和反應(yīng)溫度、加樣器加樣、重復(fù)檢測(cè)、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合等均會(huì)產(chǎn)生各自的UM分量。文獻(xiàn)研究結(jié)果表明樣品的加樣體積誤差、檢測(cè)精密度、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合和酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值的準(zhǔn)確性對(duì)UM的貢獻(xiàn)最大[1,8]。本研究分析了上述不同因素引入的UM,結(jié)果表明低、中、高值的檢測(cè)范圍與實(shí)際檢測(cè)結(jié)果均較符合。從圖1和表3可以看出,隨著標(biāo)本濃度的上升,UM不斷增大,移液器加樣引入的UM所占比例隨標(biāo)本濃度升高逐漸增加,而標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的UM隨標(biāo)本的濃度升高逐漸降低,與本室的TSGF不確定度研究結(jié)果一致[2],不同的是精密度和酶標(biāo)儀測(cè)定OD值引入的UM均很小(<0.36%);與秦緒珍等[1]的研究結(jié)果略有不同,主要原因是筆者在計(jì)算加樣引入的UM時(shí)最后一步未開(kāi)根號(hào),并且包含因子K較小,導(dǎo)致低、中、高值標(biāo)本的總UM和加樣體積分量UM所占比例較實(shí)際偏小。加樣體積引入的UM在中、高值標(biāo)本中所占比例最高,由此可見(jiàn)加樣體積的準(zhǔn)確與否直接關(guān)系到檢測(cè)結(jié)果的可靠性;而標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合對(duì)低值標(biāo)本UM影響最大,因此選擇最合理的擬合方程非常關(guān)鍵,本研究中二次方程的擬合效果要好于線性方程(r2>0.994)的擬合度。

綜上所述,在日常工作中要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)室的溫度,加樣器要按照規(guī)定到權(quán)威部門進(jìn)行檢驗(yàn)校準(zhǔn)。充分利用UM評(píng)定在實(shí)驗(yàn)室管理中的作用,提高檢測(cè)能力。

[1]秦緒珍,高學(xué)慧,徐二木,等.ELISA方法檢測(cè)CA242的不確定度評(píng)估[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2010,20(4),894-896.

[2]周艷秋,高紅軍,田穎,等.酶標(biāo)法檢測(cè)TSGF不確定度的評(píng)估分析[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2010,20(2),3355-3357.

[3]測(cè)量不確定度要求的實(shí)施指南[S].CNAS-GL05:2006.

[4]Cembal S,Ambrosio J,Aranda C,et al.Intra-assay total uncertainty of results in immunoassay techniques [J].J Immunoassay Immunochem,2004,25:1-15.

[5]化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南[S].CNAS-GL06:2006.

[6]Rothlin M A,Joller H,Largiader F.CA242 is a new tumor marker for pancreatic cancer[J].Cancer,1993,71:701-707.

[7]Kuusela P,Haglund C,Roberts PJ.Comparison of a new tumour marker CA242 with CA19-9,CA50 and carcinoembryonic antigen(CEA)in digestive tract diseases[J].Br J Cancer,1991,63:636-640.

[8]郭莉莉.酶標(biāo)法檢測(cè)人體血清中HIV-1/HIV-2型抗體結(jié)果不確定度評(píng)定[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2009,19(1),46-47.

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