王科蕊，楊 駿，黃孝春，玄振玉＊

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第三人民醫(yī)院藥劑科，上海201900；2.上海盧灣區(qū)香山中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，上海200020；3.上海玉森新藥開發(fā)有限公司研發(fā)部，上海201203）

連翹的藥用價值日益引起重視，其有效成分主要是連翹苷、連翹酯苷、齊墩果酸、熊果酸、蘆丁、木脂素和揮發(fā)油等。研究認為，連翹中真正具有抗菌功效的成分為連翹酯苷。連翹酯苷具有抗病毒、抗菌作用［1］，抑制彈性蛋白酶［2］及抗氧化等多方面藥理學(xué)活性。連翹酯苷為水溶性成分，其富集純化主要采用有機溶劑萃取法和大孔樹脂吸附法。有機溶劑萃取法多以正丁醇作為提取劑，由于正丁醇的價格高而且濃縮困難，工業(yè)生產(chǎn)時成本太高，很難大規(guī)模應(yīng)用。大孔樹脂吸附法純化得到的樣品含有多種成分，純度達不到要求。為得到純度更高的連翹酯苷，本研究采用正交試驗法優(yōu)選出硅膠柱層析提取連翹酯苷的最佳提取工藝。

1 材 料

1.1 儀器 1100型HPLC儀，G1314VWD檢測器，Agilent色譜工作站（美國Agilent公司）；Mettler Toledo AX天平［梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司］；KQ600B超聲儀（上海慧杰科技發(fā)展有限公司）；RE2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；恒溫水浴鍋（湖北省黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司）；ZKD－4025A真空干燥箱（上海智城分析儀器制造有限公司）。

1.2 藥材和試劑 連翹葉（購自河南省盧氏縣中藥材公司，批號20050802），經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實驗中心可燕副研究員鑒定為木樨科植物連翹［Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl］的干燥葉子；連翹酯苷對照品（純度98.1%，上海詩丹德生物技術(shù)有限公司，批號11／080522）；甲醇（色譜純，美國Tedia公司）；冰乙酸、乙酸乙醇、丙酮、乙醇（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）；柱層析硅膠（100～200目，上海滿賢經(jīng)貿(mào)有限公司）；AB－8大孔吸附樹脂（天津南開大學(xué)化工廠）。

2 方法和結(jié)果

2.1 溶液的配制 （1）對照品溶液：精密稱取干燥至恒重的連翹酯苷對照品適量，加50%甲醇水溶液制成約含連翹酯苷0.02mg／ml的溶液。（2）供試品溶液：精密稱定約50mg待測樣品，置50ml量瓶中，以50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度，搖勻。精密量取1ml置50ml量瓶中，加50%甲醇水溶液稀釋至刻度，搖勻，用0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得［3］。

2.2 色譜條件 色譜柱：ODS－C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇∶水∶冰乙酸（33∶67∶0.2）；檢測波長：332nm；流速：1.0ml／min；柱溫：30℃；進樣量：20μl。取對照品和供試品溶液進樣，得到色譜圖見圖1。理論塔板數(shù)按連翹酯苷峰計算應(yīng)不低于8 000［4］。

圖1 連翹酯苷的HPLC譜圖Figure 1 HPLC photograms of forsythiaside

2.3 浸膏的制備 取連翹葉200g，加入16倍量（v／w）去離子水，溫浸法（60℃）提取3次，每次1h。合并水提液，濾過，在60℃時減壓濃縮至含生藥2.0g／ml，相對密度為1.20～1.25的濃縮液，3 773 g離心30min。將上清液放冷后，上AB－8大孔吸附樹脂。樹脂用量為藥材重量的1倍，柱床徑高比為1∶10，控制吸附流速為0.25BV／h，洗脫時先用水以6BV／h的流速進行除雜，繼用60%乙醇水溶液以流速4.0BV／h洗脫。收集洗脫液，減壓濃縮，真空干燥，得干浸膏。

2.4 硅膠柱層析工藝的優(yōu)化 大孔吸附樹脂純化后得到的干浸膏中仍含有多種成分，用100～200目的層析用硅膠進一步純化。純化過程中，上樣量、洗脫液流速、柱床徑高比等因素均會對純化效率產(chǎn)生影響。本研究采用3因素3水平［L9（34）］正交試驗，考察上述3個因素對純化效果的影響。正交試驗的因素和水平設(shè)計見表1［5］。

按照正交試驗水平表安排試驗，取適量干浸膏（連翹酯苷含量為31.9%），用乙醇溶解后拌入2倍量100～200目硅膠，揮干溶劑后，取適量的100～200目硅膠，干法裝柱，干法上樣，用乙酸乙酯－丙酮－水（8∶2∶0.5）溶液洗脫，用恒流泵控制洗脫液流速，以薄層色譜法（TLC）檢測目標流份。收集目標流份，減壓濃縮，干燥，測定干浸膏得量和浸膏中連翹酯苷的百分含量。連翹酯苷得率＝［（干浸膏得量×干浸膏中連翹酯苷百分含量）／（上樣量× 31.9%）］×100%。以連翹酯苷的得率為評價指標，考察各因素對提取效率的影響。正交試驗的設(shè)計及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 正交試驗的因素和水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

由表3可見，三種因素對提取率的影響從大到小依次為：C＞A＞B，最優(yōu)組合為A3B2C3，即上樣量為1∶50，洗脫液流速為1.0BV／h，柱床徑高比為1∶10。由于上樣量為1∶50和1∶20時實驗結(jié)果差別較小，從節(jié)約成本角度考慮，確定樣品和硅膠用量比為1∶20。B因素對實驗結(jié)果影響較小，為了縮短生產(chǎn)周期，確定洗脫液流速為1.5BV／h。綜合以上直觀和方差分析結(jié)果，確定硅膠柱層析純化連翹酯苷樣品的最佳工藝為：樣品與硅膠用量比為1∶20，洗脫液流速為1.5BV／h，柱床徑高比為1∶10。2.5 驗證實驗 為了驗證最佳提取工藝的可行性與合理性，按照上述A2B3C3工藝進行3次驗證實驗。每次提取連翹葉藥材150g，分離純化得到干浸膏5.8g，其中連翹酯苷的含量占（68.73±3.67）%（n＝3）。結(jié)果表明，采用最佳工藝純化大孔樹脂提取的浸膏，連翹酯苷在浸膏中含量大幅提高，而且洗脫物得率以及連翹酯苷含量穩(wěn)定，表明本工藝可行，效果理想。

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of the orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Table 3 The results of variance analysis

3 討 論

經(jīng)大孔樹脂純化后的連翹葉提取物仍然含有多種成分，其中連翹酯苷的含量約為30%，需進一步純化。連翹酯苷常溫下為淺黃色無定型粉末，作者試用了甲醇、乙醇、丙酮等溶劑及甲醇－水、丙酮－水混合溶劑重結(jié)晶，均不能得到固定晶型，因此不能以常用的重結(jié)晶方法對其進行純化。另外，連翹酯苷在酸、堿條件下均易發(fā)生水解，因此也不能通過衍生化成鹽的方式進行重結(jié)晶純化。用硅膠柱層析對天然單體成分進行純化是實驗室及工業(yè)生產(chǎn)中常用的方法，因此本研究對大孔樹脂純化后的連翹提取物用硅膠柱層析進一步純化，確定了最優(yōu)提取工藝條件。在該條件下，得到連翹葉提取物中連翹酯苷的純度大幅度提高，可達到65%以上。

［1］ 張立偉，趙春貴，王進東，等.連翹酯甙分離提取及抑制彈性蛋白酶活性研究［J］.化學(xué)研究與應(yīng)用，2002，14（2）：219－221.

Zhang LiWei，Zhao ChunGui，Wang JinDong，et al.Study of separation，extaction and inhibiton of elastase activity of forsythiaside［J］.Chem Res Appl，2004，14（2）：219－221.Chinese.

［2］ 楊建雄，柴渭莉，邱 娟，等.連翹葉中苷類成分的分離與HPLC鑒定［J］.中成藥，2007，29（7）：1086－1087.

Yang JianXiong，Chai WeiLi，Qiu Juan，et al.Seperation and determination of glucosides in leaves of Forsythia suspensa by HPLC method［J］.Chin Tradit Patent Med，2007，29（7）：1086－1087.Chinese.

［3］ 方翠芬，靖 會，李教社，等.HPLC法測定市售連翹中連翹酯苷的含量［J］.中國藥事，2003，17（12）：760－761.

Fang CuiFen，Jing Hui，Li JiaoShe，et al.Determination of forsythoside A in merchant Forsythia suspensa by HPLC［J］.Chin Pharm Aff，2003，17（12）：760－761.Chinese with abstract in English.

［4］ 張 煒，張漢明，郭美麗，等.HPLC法測定感冒退熱顆粒（沖劑）中連翹酯苷A的含量［J］.中草藥，1999，30（4）：268－270.

Zhang Wei，Zhang HanMing，Guo MeiLi，et al.Determination of the content of forsythiaside A in Ganmaotuire granules by HPLC method［J］.Chin Tradit Herb Drug，1999，30（4）：268－270.Chinese.

［5］ 任延久，林秋梅，康 莉，等.連翹的提取工藝及有效成分的研究［J］.黑龍江醫(yī)藥，1995，8（6）：308－310.

Ren YanJiu，Lin QiuMei，Kang Li，et al.Research on the extraction and active components of Forsythia suspensa［J］.Heilongjiang Med J，1995，8（6）：308－310.Chinese.