湯細彪，劉峰，諶磊，喻紅艷，尚書,滿小營，陳楚雄，吳斌

(1.華中農業(yè)大學農業(yè)微生物學國家重點實驗室，湖北武漢 430070；2.華中農業(yè)大學動物傳染病診斷中心，湖北武漢 430070）

偽狂犬病（Pseudorabies, PR）是危害全球養(yǎng)豬業(yè)最嚴重的急性傳染病之一。豬偽狂犬病的臨床癥狀主要表現在：（1）母豬流產、產死胎、木乃伊胎；（2）公豬感染睪丸腫脹、萎縮，失去種用能力；（3）新生仔豬的死亡，仔豬的頑固性腹瀉，保育豬呼吸系統綜合癥；（4）育肥豬呼吸困難，生長延緩。該病在豬群中常呈暴發(fā)性流行，影響各個階段的豬群的生產性能。我國自1948年劉永純首次報道該病以來，迄今已有近20多個省、市（區(qū)）相繼報道發(fā)生該病，對我國的養(yǎng)豬業(yè)，尤其是集約化養(yǎng)豬帶來了巨大的經濟損失。疫苗免疫接種是預防控制與消滅豬偽狂犬病的根本措施，全球已有許多國家用不同方法培育了不少偽狂犬病弱毒株，這些疫苗在控制和凈化本國偽狂犬病中起到了非常重要的作用，本文將對我國最早研發(fā)、具有完全自主知識產權的豬偽狂犬病活疫苗(HB-98株)的分子特性及應用效果進行介紹。

一、豬偽狂犬活疫苗(HB-98株）的研發(fā)背景

偽狂犬病最早是由匈牙利的Aujeszky博士于1902年發(fā)現。我國首次報道該病是在1948年。20世紀80年代以后關于本病發(fā)生的病例數逐年增多，至20世紀90年代蔓延至20多個省市，在各個省份均出現暴發(fā)性流行（豬場的偽狂犬陽性率高達80%）。給全國的養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的損失。正是在這樣的背景下，華中農業(yè)大學動物傳染病實驗室在全國范圍內開展了豬偽狂犬病毒的分離和疫苗研發(fā)工作，并率先在我國流產母豬子宮內膜炎分泌物中分離鑒定出偽狂犬野毒，并命名為鄂A株，隨后以鄂A株為種毒，應用分子基因工程技術、反復篩選、大量臨床試驗，研制出具有完全自主知識產權的豬偽狂犬活疫苗HB-98株（TK-/gG-/gE-三基因缺失疫苗株）。

二、偽狂犬病毒基因工程疫苗(HB-98株)的分子特性

（一）安全的偽狂犬病毒基因工程疫苗須缺失TK基因作為弱毒活疫苗首先必須是安全的。歐盟提出的偽狂犬病疫苗安全性的要求包括：無局部和全身性反應；不擴散到非免疫豬；不能通過精液和胎盤傳播；致弱必須是徹底的不返強。

胸苷激酶(TK)基因位于UL區(qū)，功能為催化脫氧胸苷磷酸化。TK基因是皰疹病毒的一個主要毒力基因。TK基因的失活大大地降低了病毒毒力而不影響病毒在組織培養(yǎng)中的增殖，該基因對于病毒在中樞神經系統中的復制起著主要作用。因此安全的偽狂犬病基因工程疫苗須缺失TK基因。而且通過基因工程手段完全缺失TK基因的疫苗毒株在臨床應用中不會出現毒力返強的現象。相反，通過自然致弱的毒株沒有缺失TK基因，如Bartha K-61株在使用過程中就曾出現過疫苗毒株和野毒重組后發(fā)生毒力返強的現象。

（二）偽狂犬病毒gG基因的缺失可激發(fā)機體產生非特異性細胞免疫 偽狂犬病毒編碼的gG(gX)蛋白是一種趨化因子結合蛋白，gG蛋白通過結合趨化因子使趨化因子不能發(fā)揮功能，導致機體不易或難以識別侵入的病毒。缺失gG基因可以大幅提高疫苗激起的細胞免疫。gG基因缺失的疫苗毒株感染動物后，可提升了非特異性細胞免疫，進而游離的趨化因子濃度較未缺失gG基因的野毒株要高，起到快速清除野毒的能力。同時，gG基因的缺失可以進一步提高活疫苗的安全性。Peeters(1993)證明僅單獨缺失gE或TK基因的毒株經鼻腔免疫后可從接種豬傳播至同群飼養(yǎng)的非免疫豬；但TK-/gG-/gE-三基因缺失株在非免疫豬群中則不會傳播。所以TK-/gG-/gE-三基因缺失毒株具有更高的安全性。

（三）gE基因的缺失可應用于偽狂犬病毒的臨床鑒別診斷與疫病凈化 gE糖蛋白對病毒在神經系統中包括三叉神經節(jié)和嗅神經的擴散中發(fā)揮重要作用，但不是PRV生長所必需。所以，gE基因缺失可以進一步提高疫苗的安全性。gE-PRV毒株免疫的豬血清中，不產生針對gE糖蛋白抗原表位的抗體，而自然感染野毒株后，則可產生抗gE表位的抗體，因此通過檢測針對gE蛋白的抗體水平可以區(qū)分gE-PRV疫苗免疫豬和野毒自然感染豬，是監(jiān)測PR免疫接種和根除PR最常用的工具。

表1 偽狂犬病活疫苗HB-98株與Bartha株的區(qū)別

（四）HB-98株與其它偽狂犬疫苗毒株的分子差異性分析 豬偽狂犬病活疫苗HB-98株與國外的偽狂犬病活疫苗的主要區(qū)別體現在疫苗毒株的遺傳背景、基因改造技術、免疫原性和安全性上。首先，國外傳統疫苗主要使用的Bartha K-61株和Bucharest株，這兩株病毒均分離自歐洲，與我國的流行毒株在遺傳背景上相差較大。其次，這些毒株是通過在雞胚上自然盲傳獲得的，缺失主要毒力基因的目標性不強，隨意性較大，且并沒有缺失TK基因，存在毒力返強的風險。再次， gG基因沒有缺失，不能有效的產生非特異性細胞免疫。其主要分子差異見表1。

三、HB-98株可產生α和β干擾素，具有廣譜抗病毒作用

干擾素具有廣譜的抗病毒作用。機體在早期的病毒感染期間，干擾素即可控制病毒的生長和增殖。同時干擾素一方面可直接激活免疫細胞，另一方面可間接抑制病毒的復制過程。除此之外，干擾素還可以活化自然殺傷細胞和巨噬細胞，并且也會在機體內顯示出有效的T淋巴細胞與B淋巴細胞佐劑的作用。

偽狂犬病毒編碼的gG蛋白是一種趨化因子結合蛋白，由于gG蛋白與機體本身的趨化因子結合，使趨化因子不能發(fā)揮功能，導致機體不易或難以識別侵入的病毒。所以缺失了gG基因的HB-98活疫苗能迅速激發(fā)細胞免疫，產生大量的α和β干擾素（圖1,圖2），從而達到對病毒性疾病的治療效果。經過長時間的臨床實踐證實，HB-98激起的非特異性細胞免疫對仔豬腹瀉有很好的防控效果。

四、偽狂犬病毒基因工程疫苗(HB-98株）的臨床應用

豬偽狂犬病活疫苗HB-98株構建于1998年。經過8年實驗室試驗和臨床試驗，于2006年獲得國家新獸藥注冊證書和生產許可證。在8年的實驗室試驗和臨床試驗期間， HB-98株表現出穩(wěn)定性高、針對性強、安全性好、免疫原性強等特點。